biologia- 18.4 - 18.8
세포배양, 단백질 정제...
los primeros investigadores en cultivar celulas empleaban medios que contenian una gran variedad de sustancias desconocidas.
세포를 배양시킨 최초의 연구자들은 알려지지 않은 다양한 물질이 포함 된 배지를 사용했습니다.
El crecimiento celular se lograba con la adicion de liquidos obtenidos de sistemas vivos, como linfa, suero sanguineo, u homogeneizados de embrion. Se descubrio que las celulas necesitaban una variedad considerable de nutrimentos, hormonas factores de crecimiento y cofactores para mantenerse sanas y proliferar, Aun ahora la mayor parte de los medios de cultivos contienen grandes cantidades de suero, La importancia del suero(o los factores de crecimiento que contiene) en la proliferacion de celulas cultivadas se muestra en las curvas de crecimientos celular de la figura 16.4.
림프, 혈장(혈장은 혈액을 구성하는 액체 성분이다. 단백질을 비롯하여 다종 다양한 유기물이나 무기물이 녹아 있는 용매 역할을 한다.) 또는 배아 균질물과 같은 살아있는 시스템에서 얻은 체액을 첨가하여 세포 성장을 달성했습니다. 세포는 건강을 유지하고 증식하기 위해 상당한 양의 영양소, 호르몬, 성장 인자 및 보조 인자를 필요로하는 것으로 밝혀졌습니다. 현재 대부분의 배양 배지에는 다량의 혈장이 포함되어 있습니다. 배양 된 세포의 증식에서 혈장 (또는 성장요소를 포함하는 액체물질)의 중요성은 그림 16.4의 세포 성장 곡선에 나와 있습니다.
Uno de los principales objetivos de los cultivadores de celulas es desarrollar medios definidos libres de suero que mantegan el crecimiento de las celulas. Con un abordaje pragmatico(실용적 접근) en el que se prueban combinaciones de varios ingredientes para comprobar su capacidad para sostener el crecimiento y la profiferacion celulares, cada vez se cultivan con exito mas celulas en medio "artificiales" que carecen de suero y otros liquidos naturales. La composicion de estos mediosquimicos es relativamente compleja; consisten en una mezcla de nutrimentos y vitaminas, junto con diversas proteinas purificadas( insulina, factor de crecimiento epidermico y transferrina- que proporciona hierro a la celula-
세포 재배의 주요 목표 중 하나는 세포 성장을 유지시킬 수 있는 혈청 정의 배지를 개발하는 것입니다.
세포의 성장과 증식유지력을 테스트하기 위한 다양한 성분조합을 통하여 실용적인 접근 방식을 이용하여 더 많은 세포가 혈청 및 다른 자연적인 체액이 부족한 "인공적" 배지에서 성공적으로 배양됨.
>>이러한 화학매체의 구성은 비교적 복잡하다; 다양한 정제 단백질 (인슐린, 표피 성장 인자 및 -세포에 철분을 공급하는-트랜스페린)과 함께 영양소와 비타민의 혼합물로 구성된다.
Como son tan ricos en nutrimentos , los medios para cultivo celular son un habitat que invita al crecimiento de microorganismos . A fin de prevenir la contaminacion bacteriana de los cultivos celulares, los expertos cultivadores de tejido deben tomar medidas muy estrictas para mantener las condiciones esteriles en su espacio de trabajo. Esto se logra con el uso de guantes esteriles y la esterilizacion de todos los suministros y equipo, con el empleo de niveles bajos de antibioticos en los medios , ademas de la realizacion de las actividades bajo una campana esteril.
세포 배양 배지는 미생물이 성장하기 좋은 매력적인 서식지:영양분이 매우 풍부하기 때문에
박테리아 오염을 방지하기 위해 전문 조직 재배자는 작업 공간에서 무균 상태를 유지하기 위해 매우 엄격한 조치를 취해야한다.>멸균
-멸균 장갑을 사용
-모든 용품과 장비의 멸균
-멸균장치(campana esteril) 안에서 활동을 수행
-배지(medio)에 낮은 수준의 항생제를 사용합니다.
El primer paso en el cultivo celular es la obtencion de celulas. En la mayor parte de los casos solo debe extraerse una ampolleta de celulas congeladas cultivadas con anterioridad de un tanque de nitrogeno liquido, descongelar la ampolleta y transferir las celulas al medio de espera. Un cultivo de este tipo se conoce como CULTIVO SECUNDARIO porque las celulas provienen de un CULTIVO PREVIO. En un CULTIVO PRIMARIO las celulas se obtienen del organismo. Casi todos los cultivos primarios de celulas animales se toman de embriones, cuyos tejidos se disocian con mas facilidad en celulas que los tejidos de los adultos. La disociacion se efectua con la ayuda de una enzima proteoliticas, como la tripsina ( La fragmentacion se logra dentro de un espectrometro de masa mediante la colision de los peptidos con un gas inerte. La energia del choque reompe los enlaces peptidicos para producir una coleccion aleatoria de fragmentos del peptido orginal. La secuencia de aa de cada fragmentos del poptido orginal. La secuencia de aa de cada fragmento, y por lo tanto del peptido orginal, puede determinarse si se busca en una base de datos que contenga las masas de los fragmentos teoricos con todas las secuencias posibles de aa que pueden formarse a partir de las proteinas codificadas por ese genoma.)
세포 배양의 첫 번째 단계는 세포를 얻는 것.
대부분의 경우, 이전에 성장시켜 둔 냉동 세포의 한 바이알(ampotella) 만 액체 질소 탱크에서 꺼내어 바이알을 해동 한 다음 세포를 보유 배지로 옮겨야한다. 이러한 CULTIVO는 세포가 이전 CULTIVO에서 왔기 때문에 SECONDARY CULTIVE로 알려져 있습니다. 일차 문화에서 세포는 몸에서 얻습니다. 거의 모든 1 차 동물 세포 배양은 배아에서 채취되며, 그 조직은 성인 조직보다 세포로 더 쉽게 해리됩니다. 분리는 트립신과 같은 단백질 분해 효소의 도움으로 이루어집니다. (단백질은 펩타이드를 질량 분석기 내에서 불활성 기체와 충돌시킨다. 충격 에너지는 펩타이드 결합을 파괴하여 원래의 단편을 무작위로 수집합니다. 펩타이드. 원래 팝 타이드의 각 단편의 aa 서열. 각 단편의 aa 서열, 따라서 원래 펩타이드의 aa 서열은 형성 될 수있는 모든 가능한 aa 서열과 함께 이론적 단편의 질량을 포함하는 데이터베이스를 검색하여 결정할 수 있습니다. 그 게놈에 의해 암호화 된 단백질에서.)
, que digiere los dominios extracelulares de las proteinas que median la adhesion celular (cap. 7). Luego el tejido se lava para eliminar la enzima y por lo general se suspende en una solucion salina que carece de iones Ca 2+ y contiene una sustancia, como tetraacetato de etilenediamina (EDTA), que se une (quela) con los iones de calcio. como se explica en el capitulo 7, los iohes de calcio desempenan una funcion clave en la adhesion celular y su eliminacion de los tejidos facilita mucho la separacion de las celulas., 이것은 세포 접착을 매개하는 단백질의 세포 외 도메인을 소화합니다 (7 장). 그런 다음 조직을 세척하여 효소를 제거하고 일반적으로 Ca 2+ 이온이없고 2가 양이온과 결합 (킬레이트)하는 물질 (예 : 에틸렌 디아민 테트라 아세테이트 (EDTA))을 포함하는 염수 용액에 현탁(액체에 완전히 용해되지 않은 물질이 섞여 있는 것.)합니다. 7 장에서 설명한 바와 같이 칼슘 이온은 세포 부착에 중요한 역할을하며, 조직에서 제거하면 세포 분리가 크게 촉진된다
Las celulas normales (no malignas) pueden dividirse una cantidad limitada de veces( por lo general 50 a 100) antes de envejecer y morir. Por ello muchas de las celulas que suelen usarse eb los estudios con cultivo de tejido se someten a modificaciones geneticas que les permiten crecer por tiempo indefinido. Las celulas de este tipo se conocen como linea celular y casi siempre crecen para formar tumores malignos cuando se inyectan en animales de laboratorio susceptibles. La frecuencia con la que una celula normal que crece en cultivo se transforma de manera espontanea en una linea celular de pende del organismo del que proviene. Por ejemplo, las celulas de raton se transforman con una frecuencia mas o menos altas; las celulas humanas se transforman solo raras veces, si es que sucede. Las lineas celulares humanas(Ccelulares HeLa) suelen derivarse de tumores humanos o de celulas tratadas con virus o sustancias que causan cancer.
정상 (비 악성) 세포는 노화 및 죽기 전에 제한된 횟수 (일반적으로 50 ~ 100 회)로 분열 할 수 있습니다. 이러한 이유로 조직 배양 연구에 일반적으로 사용되는 많은 세포는 유전 적 변형을 거쳐 무한정 성장할 수 있습니다. 이 유형의 세포는 세포주(linea celular)로 알려져 있으며 민감한 실험 동물에 주사하면 거의 항상 악성 종양을 형성하도록 성장합니다. 배양에서 자라는 정상 세포가 자발적으로 세포주로 변하는 빈도는 그것이 나오는 유기체에 따라 다릅니다. 예를 들어, 마우스 세포는 다소 높은 빈도로 변형됩니다. 인간 세포는 거의 변형되지 않습니다. 인간 세포주 (HeLa 세포)는 일반적으로 인간 종양 또는 암을 유발하는 바이러스 또는 물질로 처리 된 세포에서 파생됩니다.
Varios laboratorios estan dejando atras los sistemas de cultivo bidimensional tradicionales, en los que las celulas crecen sobre una superficie plana o una caja de cultivo, y se estan orientando a los sistemas tridimensionales, en los que las celulas crecen en una matriz tridimensional consistente en materiales extracelulares sinteticos, naturales o ambos. Estos materiales pueden adquirirse como productos que contienen proteinas y otros componentes derivados de membranas basales naturales.
몇몇 실험실은 세포가 평평한 표면이나 배양 상자에서 성장하는 전통적인 2 차원 배양 시스템에서 벗어나 물질로 구성된 3 차원 매트릭스에서 합성 세포 외 물질, 자연적물질 또는 두가지 모두를 이용한 물질에서 세포가 성장하는 3 차원 시스템으로 이동하고 있습니다. 이러한 물질은 천연 기저막에서 추출한 단백질 및 기타 성분이 포함 된 물질에게서 얻을 수 있습니다.
Las celulas en el cuerpo no viven en superficie planas y duras como plasticos y por consiguente, se cree que las matrices tridimensionales brindan un ambiente muchos mas natural para las celulas cultivadas. Por consiguentes. la morfologia y comportamiento de las celulas en estos ambientes tridimensionales se parecen mas a las celulas observadas en los tejidos del cuerpo. Esto se refleja en las diferencias de la organizacion citoesqueletica, tipos de adhesiones celulares, actividades de senalizacion y estados de diferenciacion de las celulas en los dos tipos de sistemas cultivo. Ademas, Los sistemas de cultivo 3D tambien son mas adecuados para estudiar las interacciones entre celulas porque les permiten estar en contacto unas con toras en culaquier punto de su superficie. La figura 18.22a esta presionada contra el sustrato, los que crea una superficie superior(dorsal) e inferior (ventral) muy poco natural con lamelipodios demasiado anchos y aplanados. En cambio, el mismo tipo de celulas en cultivo 3D (fig. 18.22b) tiene una estructura fusiforme tipica sin diferenciacion superficial evidente.
체내 세포는 플라스틱과 같은 평평하고 단단한 표면에 살지 않기 때문에 3 차원 매트릭스는 배양 된 세포에 훨씬 더 자연스러운 환경을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 3 차원 환경에서 세포의 형태와 행동은 신체 조직에서 보이는 세포와 더 유사합니다. 이것은 두 가지 유형의 배양 시스템에서 세포 골격 조직, 세포 부착 유형, 신호 전달 활동 및 세포 분화 상태의 차이에 반영됩니다. 또한 3D 배양 시스템은 세포 표면의 어느 지점에서나 서로 접촉 할 수 있기 때문에 세포 상호 작용을 연구하는 데 더 적합합니다. 그림 18.22a를 기판에 대고 누르면 너무 넓고 평평해진 얇은 판이있는 매우 부 자연스러운 상부 (등쪽) 및 하부 (배쪽) 표면이 생성됩니다. 대조적으로, 3D 배양에서 동일한 유형의 세포 (그림 18.22b)는 명백한 표면 분화가없는 전형적인 방추형 구조를 가지고 있습니다.
Muchos tipos distintos de celulas vegetales tambien pueden crecer en cultivo. En una tecnica, las celulas vegetales se tratan con la enzima celulasa, que digiere la pared celular y libera la celula desnuda o protoplasto. Entonces los protoplastos pueden cultivarse en un medio quimico definido que promueve su crecimiento y division. EN las condiciones adecuadas las celulas pueden crecer en un cumulo indiferenciado de celulas llamado callo, en el que es posible inducir el desarrollo de brotes de los que la planta pueden regenerarse. En una tecnica alternativa, con tratamiento hormonal puede hacerse que las celulas del tejido de la hoja pierdan sus propiedades diferenciadas y se transformen en material de callo. El callo puede transferirse despues a un medio liquido para iniciar un cultivo celular.
다양한 유형의 식물 세포도 배양에서 자랄 수 있습니다. 한 기술에서 식물 세포는 효소 셀룰라아제로 처리되어 세포벽을 소화하고 네이 키드 세포 또는 원형질체(박테리아, 식물세포, 곰팡이 등과 같이 외막을 가지는 세포의 외막을 제거한 것을 의미)를 방출합니다. 원형질체는 성장이나 분열을 촉진하는 정의 된 화학 배지에서 배양 될 수 있습니다. 적절한 조건 하에서 세포는 캘러스라고하는 미분화 세포 클러스터에서 성장할 수 있으며, 식물이 재생 될 수있는 새싹의 발달을 유도 할 수 있습니다. 대체 기술에서, 호르몬 처리를 통해 잎 조직의 세포가 분화 된 특성을 잃고 캘러스 물질이되도록 만들 수 있습니다. 캘러스를 액체 배지로 옮겨 세포 배양을 시작할 수 있습니다.
* 분화(differentiation) 혹은 세포 분화(細胞分化, cellular differentiation)는 어떠한 세포가 다른 특징을 갖는 세포로 바뀌는 것을 말한다.
18.6 FRACCIONAMIENTO DEL CONTENIDO DE UNA CELULA MEDIANTE CETRIFUGACION DIFERENCIAL
차등 원심 분리를 통한 세포 함량의 분할
La mayor parte de las celulas contiene una variedad de organelos distintos. Si se pretende estudiar una funcion particular de las mitocondrias o aislar una enzima particular del aparato del Golgi, es conveniente aislar primero el organelo relevante en estado purificado. El aislamiento de una organelo particular en gran cantidad suele lograrse mediante la tecnica de centrifugacion diferencial, que depende del principio de que, en tanto sean mas densas que el medio circundante, las particulas de diferente tamano y forma viajan hacia el fondo de un tubo centrifugado a distintas velocidades cuando se colocan en un campo de centrifugacion.
대부분의 세포는 다양한 세포 기관을 포함합니다.
미토콘드리아의 특정 기능을 연구하거나 골지체에서 특정 효소를 분리하려는 경우 먼저 정제 된 상태에서 세포 기관을 분리하는 것이 바람직합니다. 특정 세포 기관의 대량 분리는 일반적으로 차등 원심 분리 기술에 의해 이루어 진다. 이는 주변 매질보다 밀도가 높은 다른 크기와 모양의 입자가 원심 분리 필드에 배치 될 때 다른 속도로 원심 분리 튜브의 바닥으로 이동한다는 원리에 따라 달라집니다.
Para efectuar esta tecnica se procede primero a la rotura mecanica de las celulas con un homogeneizador mecanico. LAS CELULAS SE HOMOGENIZAN EN UNA SOLUCION AMORTIGUADA isotonica( que a menudo contiene sacarosa), lo que previene la rotura de las vesiculas de membrana por osmosis. El homogeneizado se somete a una serie de centrifugaciones secuenciales cada vez con mayor fuerza centrifuga. los pasos de esta tecnica se explican en el capitulo 8 y se ilustran en la figura 8.5.
이 기술을 수행하기 위해 먼저 균질기를 사용하여 세포를 기계적으로 분해합니다. 세포는 (종종 슈크러스를 포함한) 완충제 (buffet)에서 균질화되어 삼투에 의한 막 소포의 파열을 방지합니다. 균질물은 원심력을 증가시키면서 일련의 순차적 원심 분리를 거칩니다. 이 기술의 단계는 8 장에 설명되어 있으며 그림 8.5에 설명되어 있습니다.
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■ 세포분획, 세포분획법, 원심분획법, 원심분리
■ 세포분획법 또는 원심분획법 원심력을 이용하여 세포 소기관을 분리 후 획득한다. 원심 분리에 영향을 ...
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Al principio el homogenizado se somete a fuerzas centrifugas bajas por un periodo corto para que olo los organelos celulares mas grandes, como los nucleos (y cualquier celula completa remanente), se sedimenten en una "partilla". Los organelos citoplasmicos relativamente grandes (mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas) pueden separarse de las suspension con fuerzas centrifugas mayores.
Los microsomas (fragmentos de membranas vacuolares y reticulares del citosol) y los ribosomas de la suspension se retiran en los pasos subsiguientes. Este ultimo paso requiere la ultracentrifuga, que puede generar velocidades de 75000 revoluciones por minutos que producen fuerzas equivalentes a 500 000 veces la gravedad. Una vez que los ribosomas se retiran, el sobrenadante consiste en la fase soluble de las celulas y las particulas demasiado pequenas para retirarse por sedimentacion.
초기에 균질 물은 짧은 기간 동안 낮은 원심력을 받아 핵 (및 나머지 전체 세포)과 같은 가장 큰 세포 소기관 만 "입자"로 정착합니다. 상대적으로 큰 세포질 세포 소기관 (미토콘드리아, 엽록체, 리소좀 및 퍼 옥시 좀)은 더 큰 원심력으로 현탁액에서 분리 될 수 있습니다. 마이크로 솜 (세포질의 액포 및 망상 막의 단편) 및 현탁액에서 리보솜은 후속 단계에서 제거됩니다. 이 마지막 단계에는 분당 75,000 회전의 속도를 생성 할 수있는 초 원심 분리기가 필요하며, 이는 중력의 500,000 배에 해당하는 힘을 생성합니다.
리보솜이 제거되면 상층 액은 세포의 용해적 단계와 침전으로 제거 할 수없는 너무 작은 입자로 구성됩니다.
Puesto que los pasos iniciales de la centrifugacion diferencial no producen preparaciones puras de un organelo particular, casi siempre se requieren pasos adicionales. En muchos casos se logra una purificacion adicional mediante centrifugacion de una de las fracciones a travez de un gradiente de densidad, como se muestra en la figura 18.23, los que distribuye le contenido de la muestra en varias capas de acuerdo con su densidad. La composicion de varias fracciones puede determinarse con el examen microscopicos o la medicion de las cantidades de protenias particulares conocidas como especificas de organelos particulares.
차등 원심 분리의 초기 단계는 특정 세포 기관의 순수한 준비를 생성하지 않기 때문에 추가 단계가 거의 항상 필요합니다. 많은 경우, 밀도에 따라 샘플의 내용물을 여러 층으로 분배한다. 밀도의 농도차를 통해 분획된 내용물 중 하나를 원심 분리하여 추가 정제를 합니다. 다양한 분획으로 구성된 내용물을 현미경으로 관측하거나 또는 세포 기관의(특정 기관마다 다른) 단백질의 양을 측정하여 결정할 수 있습니다.
Los organelos celulares aislados por centrifugacion diferencial conservan un nivel notable de actividad normal, siempre que no se expongan a condiciones desnaturalizantes durante el aislamiento. Los organelos aislados con este procedimiento pueden usarse en sistemas libres de celulas para estudiar una gran variedad de actividades celulares, incluida la sintesis de proteinas unidas a la membrana, formacion de versiculas de tranporte, sintesis de DNA, y el transporte de solutos y desarrollo de gradientes ionicos.
차동 원심 분리에 의해 분리 된 세포 소기관은 분리 중에 변성 조건에 노출되지 않는 한 현저한 수준의 정상 활동을 유지합니다. 이 절차로 분리 된 소기관은 세포가없는 시스템에서 막 결합 단백질 합성, 수송 소포 형성, DNA 합성, 용질 수송 및 이온 구배의 개발을 포함한 다양한 세포 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
세포분획법 알아보기.
세포 내에는 세포소기관이 있습니다. 세포 소기관의 구조나 기능을 어떻게 알아낼수있는걸까요? ...
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18.7 aislamiento, purificacion y fraccionamiento de proteinas 단백질의 분리, 정제 및 분별
En el curso de este libro se consideran las propiedades de muchas proteinas. LA PROTEINA DEBE AISLARSE EN UN ESTADO RELATIVAMENTE PURO ANTES DE PODER OBTENER INFORMACION DE LAS ESTRUCTURA O LA FUNCION DE UNA PROTEINA PARTICULAR, cOMO LA MAYOR PARTE DE LAS CELULAS CONTIENE MILES DE PROTEINAS DIFERENTES, la purificacion de una sola especie puede ser todo un desafio, en especial si la proteina se encuentra en baja concentracion en la celula. En esta seccion se revisan de manera breve solo algunas de las tecnicas empleadas para purificar las proteinas.
이 단원에서는 많은 단백질의 특성을 공부한다.
단백질은 특정 단백질의 구조 또는 기능에 대한 정보를 얻기 전에 상대적으로 순수한 상태에서 분리되어야 한다.
대부분의 세포에는 수천 개의 다른 단백질이 포함되어 있기 때문에, 한가지 종류의 정제는 특히 단백질이 세포에서 낮은 농도에있는 경우 어려울 수 있다. 이 섹션에서는 단백질 정제에 사용되는 기술 중 일부만 간략하게 검토한다.
Por lo general la purificacion de una proteina se realiza mediante la eliminacion de los contamianates por pasos. Est posible que dos proteinas sean muy similares en cuanto a una propiedad, como la carga general, y muy distintas en otra, como el tamano o la forma moleculares. Por consiguente, la purificacion completa de una proteina determinada suele requerir el uso de tecnicas sucesivas que aprovecha las diferentes propiedades de las proteinas que se separan. La purificacion se mide como un incremento en la actividad especifica, que es el indice entre la cantidad de esa proteina y el total de proteina presente en la muestra. Debe emplearse algun rasgo identificable de la proteina especifica como prueba para identificar la cantidad relativa de esa proteina en la muestra. Si la proteina es una enzima, puede recurrrirse a su actividad catalitica como prueba para vigilar la purificacion. Una alternatvia consiste en basar las pruebas en criterios inmunologicos, electroforeticos, microscopicos electronicos u otros. Las mediciones de la proteina total en una muestra pueden hacerse con varias propiedades, inclusive el nitrogeno total, que puede medirse con gran precision y es bastante constante en cerca de 16% del peso seco de todas las proteinas.
일반적으로 단백질 정제는 단계적으로 오염 물질을 제거한다.
두가지의 단백질이 (전체 전하와 같은) 유사한 속성을 가지고 (분자 크기 또는 모양과 같은) 다른 속성에서는 매우 다를 수 있기 때문에, 주어진 단백질을 완전히 정제하려면 일반적으로 연속 기술을 사용해야한다. 정제는 특정한 활동의 증가로 측정되며, 이는 해당 단백질의 양과 샘플에 존재하는 총 단백질 간의 비율이다. 일부 식별 가능한 단백질의 특성은 샘플에서 해당 단백질의 상대적인 양을 구별하기위한 테스트를 사용할 수 있다.
단백질이 효소 인 경우, 그 촉매활동(actividad catalitica)를 이용할 수 있습니다. 다른 방법들은 면역학적, 전기 영동, 전자 현미경 또는 기타 기준에 근거하여 시험하는 것입니다. 시료의 총 단백질 측정은 질소함유량 측정을 포함한 다양한 특성으로 관찰 할 수 있으며, 이는 매우 정밀하게 측정 할 수 있으며 모든 단백질의 건조 중량의 약 16 %에서 상당히 일정합니다.
PRECIPITACION SELECTIVA 선택적 집약
El primer paso en la purificacion selectiva debe ser uno que pueda realizarse en una preparacion muy impura y pueda producir una gran aumento en la actividad especifica. Por lo general el primer paso aprovecha las diferencias en la solubilidad entre las proteinas mediante la precipitacion selectiva de la proteina deseada. Las propiedades de solubilidad de una proteina dependen mucho de la distribucion de cadenas laterales hidrofilas e hidrofobas en su superficie. La solubilidad de una proteina en una solucion determinada dependen de un equilibrio relativo entre las interaccciones proteinas- solvente que la mantienen en solucion y delas interraciones proteinas- proteinas que hacen que se agregue y precipite de la solucion. La sal que mas se utiliza para la precipitacion selectiva de proteinas es el sulfato de amonio, que es
-muy soluble en agua
-tiene una gran fuerza ionica.
La purificacion se logra mediante la adicion gradual de una solucion saturada de sultafo de amonio al extrato crudo de proteina. Conforme la adicion de la sal continua, la precipitacion de las proteinas contaminante aumenta y el precipitado puede desecharse. Al final se alcanza un punto en el que la proteina que se busca se separa de la solucion. Este punto se reconoce por la perdida de actividad en la fraccion soluble cuando se prueba con el ensayo particular que se utilice. Una vez que la proteina deseada se precipita, las proteinas contaminantes se dejan en la solucion, mientras que la proteina buscada puede disolverse de nuevo.
선택적 정제의 첫 번째 단계는
-매우 불순한 제제에서 수행 할 수 있고
-특정 활동을 크게 증가시킬 수있는 단계 여야 합니다.
일반적으로 첫 번째 단계는 원하는 단백질의 선택적 침전에 의한 단백질 간의 용해도 차이를 이용한다.
단백질의 용해도 특성은 표면의 소수성 및 친수성 cadena lateral 분포에 크게 의존합니다.
주어진 용액에서 단백질의 용해도는 용액을 유지하는 단백질-용매 상호 작용과 용액에서 응집 및 침전되도록하는 단백질-단백질 상호 작용 간의 상대적 평형에 따라 달라집니다. 단백질의 선택적 침전에 가장 많이 사용되는 용액은 황산 암모늄으로
-물에 매우 잘 녹고
-이온 강도가 높습니다..
정제는 crudo 단백질 추출물에 황산 암모늄의 포화 용액을 점진적으로 첨가하여 달성됩니다. Sal의 첨가가 계속되면 오염 단백질의 침전이 증가하고 침전물을 버릴 수 있다.
결과적으로 원하는 단백질이 용액에서 분리되는 지점에 도달하도록 해야 한다. 이 점은 사용된 특정 분석법으로 테스트 할 때 가용성 분획의 활성 손실로 인식됩니다. 원하는 단백질이 침전되면 오염 된 단백질은 용액에 남겨지고 원하는 단백질은 다시 용해 될 수 있습니다.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA EN COLUMNA 액체 칼럼 크로마토 그래피
cromatografia: termino que designa varias tenicas en las que UNA MEZCLA DE COMPONENTE DISULETOS se fraccion a su paso por cierto tipo de matriz porosa. En las tenicas de cromatografia liquida, los componetes en una mezcla pueden unirse con una de dos fases alternativas
-una fase movil, consistente en un solvente en movimiento,
-y una fase inmovil, que es la matriz a travez de la cual se mueve el solvente.
La fase inmovil consiste en materiales que se empacan en una columna.
크로마토그래피 : 특정 유형의 다공성 매트릭스를 통과 할 때 용해된 구성 요소의 혼합물이 분별되는 여러 기술을 지정하는 용어. 액체 크로마토 그래피 기술에서 혼합물의 성분은 두 가지 대체 단계 중 하나와 결합 될 수 있습니다.
-움직이는 용매로 구성된 이동단계,
-용매가 이동하는 매트릭스 인 고정단계- 용매가 이동하는 매트릭스입니다.
La prteinas que van a fraccionarse se disuelen en un solvente y luego se pasan por la columna. Los materiales que conforman la fase inmovil contienen sitio a los que las proteinas en solucion pueden unirse. Conforme las moleculas de proteinas individual interactuan con los materiales de la matriz, su progreso por la columna se retrasa. Por lo tanto, mientras Mayor sea la afinidad de una proteinas particular por el material de la matriz, su paso por la columna es mas lento.
분별할 슬라이드를 용매에 용해시킨 다음 컬럼을 통과시킵니다. 고정단계을 구성하는 물질은 용액의 단백질이 결합 할 수있는 부위를 포함합니다. 개별 단백질 분자가 매트릭스 물질과 상호 작용함에 따라 컬럼을 통한 진행이 지연됩니다. 따라서 매트릭스 물질에 대한 특정 단백질의 친화성(상호작용)이 클수록 컬럼을 통과하는 속도가 느려집니다.
Como las diferentes proteinas de la mezcla tienen distintas afinidad por la matriz, se retrasan en diferente medida.
혼합물의 다른 단백질은 매트릭스에 대해 서로 다른 친화성을 가지기 때문에 지연되는 속도가 다르다.
Conforme el solvente pasa por la columna y gotea del fondo, se recolecta como fracciones en una serie de tubos. Las proteinas en la mezcla con la menor afinidad por la columna aparecen en las primeras fracciones que salen de la columna. La resolucion de muchos procedimientos cromatograficos mejoro en los ultimos anos gracias al desarrollo de la cromatografia liquida de altos desempeno (HPLC, high performance liquid chormatography), en la que se usan columna largas y delgadas, y la fase movil se obliga a pasar por una matriz apretada no compresible compuesta por particulas muy pequenas ( por ejemplo, 5 um de diametro)- 마이크로미터!! que esta sometida a alta presion
용매가 컬럼을 통과하고 바닥으로 떨어지면,튜브에서 분획된 형태로 모아 진다.
컬럼에 대한 친화성이 가장 낮은 혼합물의 단백질은 컬럼을 떠나는 첫 번째 분획에 나타납니다. 최근 몇 년 동안 고성능 액체 크로마토 그래피의 개발 덕분에 많은 크로마토 그래피 절차의 해상도가 향상되었습니다. (HPLC, 고성능 액체 chormatography),
-긴 컬럼과 얇은 컬럼을 사용
-이동단계에서 통과하는 매우 작은 입자로 구성된 단단한 비압축성 매트릭스에 의해 (예 : 직경 5um)- 마이크로 미터 !!
-높은 압력을 받는다.
단백질 정제의 십계명 5. 이온교환크로마토그래피를 사랑하라
꽤 오랫만에 쓰는 시리즈물의 최신 에피소드가 되겠음. 지금까지의 ‘계명’ 은.. 1. 단백질은 단백질마다 다 다르니 그들의 특성을 잘 파악할지어다. 2. 폴리펩타이드 결합은 언젠가 끊어질지니
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO 이온교환 크로마토그래피
Las proteinas son electrolitos polivalentes grandes y es improbable que muchas proteinas en una preparacion de preza parcial tengan la misma carga general. La carga general de una preteina es la suma de todas las cargas individuales de sus aa componente.
Como la carga de cada aa depende del pH del medio, la carga de cada proteina tambien depende del pH. Cuando el pH disminuye, los grupos con carga negativa se neutralizan y los grupos con carga positiva se vuelven mas numerosos. Lo contrario ocurre cuando el pH aumenta. Existe un pH para cada proteina en el que el numero total de carga negativas es igual al de cargas positivas. Este pH es el punto isoelectrico, en el que la proteina es neutra. El punto isoelectrico de la mayor parte de las proteinas esta por debajo del pH 7.
단백질은 큰 다가 전해질이며, 부분 준비 제제의 많은 단백질이 동일한 전체 전하를 가질 가능성은 낮다.
단백질의 일반적인 전하는 구성 요소 aa의 모든 개별 전하의 합이다. 각 aa의 전하는 배지의 pH에 따라 다르므로 각 단백질의 전하는 pH에 따라 다릅니다.
pH가 감소:음전하가 중화되고 양 전하가 더 많아진다.
PH 증가: 양전하의 중화, 음전하가 늘어남.
각 단백질의 총 음전하 개수가 양전하 개수와 동일한 pH가 있다. 이 pH를 등전점(punto isoelectronico)이라고 하며, 이때의 단백질은 중성이다. 대부분의 단백질의 등전점은 pH 7 미만이다.
La carga ionica se usa como basa para la purificacion en diversas tecnicas, incluida la CROMATOGRAFIA CON INTERCAMBIO IONICO. Esta depende de los enlaces ionicos de proteinas con un material matriz inerte, como la celulosa, que contiene grupos con carga electrica unidos por enlace covalentes. Dos de las resinas de intercambio ionico mas usuales son la dietilaminoetilcelulosa (DEAE) y la carboximetilcelulosa (CM). La DEAE- celuosa posee carga negativa y es intercambiador de cationes. La resina se empaca en una columna y se permite que la solucion de la proteina pase por la columna en un amortiguador cuya composicion promueve la union de alguns o todas las proteinas con la resina. Las proteinas se unen con la resina en forma reversible y pueden desplazarse por el aumento en la fuerza ionica del amortiguador(que agrega iones para competir con los grupos cargados de las macromoleculas para sitios en la resina) o por el cambio de su pH. Las proteinas se extraen de la columna en orden, de la que tiene una union menos fuerte a la unida con mayor fuerza. La figura 18.24 muestra una representacion esquematica de la separacion de dos especies de proteinas mediante la extraccion por paoss de una columna de intercambio ionico
이온 전하는 ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY를 포함한 다양한 기술에서 정제의 기초로 사용된다. 이는 셀룰로오스-공유 결합으로 이루어진 전하를 띤 기(grupo con carga eletrica)를 포함한다)와 같은 불활성 매트릭스 물질과 단백질의 이온 결합에 따라 달라집니다.
가장 일반적인 이온 교환 레진(resin-나뭇진 또는 수지는 나무에서 분비되는 탄화수소로 된 끈끈한 진을 말한다.) 중 두 가지는:
디 에틸 아미노 에틸 셀룰로오스 (DEAE)와
카르복시 메틸 셀룰로오스 (CM)이다.
DEAE- 셀룰로오스: 음전하(carga negativa)를 띠며 양이온 교환기(intercambiador de cationes). 레진은 컬럼에 포장? (empaca)되고 단백질 용액은 그 조성이 일부 또는 모든 단백질의 레진에 대한 결합을 촉진하는 완충액에서 컬럼을 통과하도록합니다. 단백질은 레진에 가역적(forma reversible)으로 결합하며 완충액의 이온 강도 증가 (레진의 부위에 거대 분자의 하전된 그룹과 경쟁하기 위해 이온 추가) 또는 pH 변경에 의해 대체 될 수 있습니다. 단백질은 가장 강한 결합력을 가진 것부터 가장 강한 힘을 가진 것까지 순서대로 컬럼(columna)에서 추출한다.
그림 18.24는 이온 교환 컬럼에서 단계적으로 추출하여 두 가지 단백질 종의 분리를 개략적으로 보여줍니다.
figura 18.24 Cromatografia por intercambio ionico
separacion de dos proteinas mediante DEAE- celulosa. En este caso, una resina de intercambio con carga positiva se usa para unirse con la proteina con mayor carga negativa.
그림 18.24 이온 교환 크로마토 그래피 DEAE- 셀룰로오스에 의한 두 단백질 분리. 이 경우 양전하를 띤 교환 레진를 사용하여 더 음전하를 띤 단백질과 결합합니다.
figura 18.25 cromatografia de filtracion en gel.
Separacion de tres proteinas globulares con diferentes masas molecular, como se describe en el texto. Entre las proteinas con forma basica similar, las moeculas mas grandes se eliminan antes que las pequenas.
그림 18.25 겔 여과 크로마토 그래피. 텍스트에 설명 된대로 서로 다른 분자 질량을 가진 세 개의 구형 단백질의 분리. 유사한 기본 모양을 가진 단백질 중 큰 분자는 작은 분자보다 일찍 제거됩니다.
단백질 정제의 십계명 6. 마무으리에는 젤 여과 크로마토그래피를 기억하라
참으로 오랫만에 쓰는 시리즈 최신판이다. 지금까지의 ‘계명’ 은.. 1. 단백질은 단백질마다 다 다르니 그들의 특성을 잘 파악할지어다. 2. 폴리펩타이드 결합은 언젠가 끊어질지니 단백질 분해
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CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL 젤 필터 크로마토 그래피
La filtracion en gel separa proteinas ( o acidos nucleicos) con base en su tamano efectivo (radio hidrodinamico). Como la cromatografia de intercambio ionico, el material de separacion consiste en cuentas diminutas que se empacan en una columna a traves de la cual la solucion de proteina pasa lentamente. Los materiales que se emplean en la filtracion por gel se componen de polisacaridos con enlaces cruzados (dextranos o agarosa) de distintas porosiad, lo que permite que las proteinas se difundan dentro y fuera de las cuentas. La major forma de describir la tecnica es con un ejemplo.
젤 필터는 유효 크기-tamano efectivo (유체 역학적 반경)에 따라 단백질 (또는 핵산)을 분리합니다. 이온 교환 크로마토 그래피와 마찬가지로 분리 물질은 단백질 용액이 천천히 통과하는 컬럼에 채워진 작은 구슬로 구성됩니다. 젤 필터에 사용되는 물질은 다공성이 다른 가교 다당류 (dextrans 또는 agarose)로 구성되어있어 단백질이 비드 안팎으로 확산 될 수 있습니다. 기술을 설명하는 가장 좋은 방법은 예제를 사용하는 것입니다.
Supongase que se intenta purificar una proteina globular con una masa molecular de 125 000 daltones. Esta proteina se encuentra en solucion con dos proteinas contamianates con forma similar, una mucho mas grande de 250 000 daltones , y la otra mucho mas pequeda de 75000 datones. Un modo en que la proteina podria purificarse consiste en pasar la mezcla por una columna de cuentas Sephadex G-150, que permite la entrada de proteinas globulares menores de 200kDa. Cuando la mezcla de proteinas pasa por el lecho de la columna, la proteina de 250KDa se extrae en cuanto el solvente de la columna (el volumnen del lecho) termina de gotear. En cambio, las otras dos proteinas pueden difundirse a los intersticios entre las cuentas y su paso por la columna se retrasa. Conforme mas solvente pasa por la columna, estas proteinas se mueven hacia abajo y salen por el fondo, pero lo hace a distintas velocidades. Entre las proteinas que entran a las cuentas, las especies mas pequenas se retrasan mas que las grandes. Por consiguente la proteina de 125kDa se extrae en estado purificado, en tanto que la proteina de 75 kDa permanece en la columna.
분자 질량이 125,000 달톤 인 구형 단백질을 정제하려고한다고 가정합니다. 이 단백질은 비슷한 모양의 오염 단백질 두 개가있는 용액에서 발견됩니다. 하나는 250,000 달톤으로 훨씬 더 크고 다른 하나는 75,000 daton으로 훨씬 더 작습니다. 단백질을 정제 할 수있는 한 가지 방법은 혼합물을 Sephadex G-150 비드 컬럼을 통해 통과시켜 200kDa 미만의 구형 단백질의 유입을 허용하는 것입니다. 단백질 혼합물이 컬럼 베드를 통과 할 때 컬럼 용매 (베드 부피)가 떨어지는 즉시 250KDa 단백질이 제거됩니다. 대신 다른 두 단백질은 비드 사이의 틈새로 확산 될 수 있으며 컬럼을 통한 통과가 지연됩니다. 더 많은 용매가 컬럼을 통과함에 따라 이러한 단백질은 아래쪽으로 이동하고 아래쪽으로 이동하여 다른 속도로 이동하게 된다. 구슬로 통과하는 단백질 중 작은 종은 큰 종보다 뒤쳐집니다. 결과적으로 125kDa 단백질은 정제 된 상태에서 추출되고 75kDa 단백질은 컬럼에 남아 있습니다.
젤 여과 크로마토그래피에서는 큰 넘이 먼저 나오고, 작은 넘이 늦게 나온다
CROMATOGRAFIA POR AFINIDAD 친화 크로마토그래피
Las tecnicas descritas hasta ahora utilizan las propiedades gruesas de una proteinas para realizar la purificacion o el fraccionamiento. Otra tecnica de purificacion llamada cromatografia por afinidad aprovecha las propiedades estructurales unicas de una proteinas, lo que permite que una especie de proteinas se retire de manera especifica de la solucion mientras que las demas quedan en esta. Las proteinas interactuan con sustancias especificas: enzimas con sustratos, receptores con ligandos, antigenos con anticuerpos, etc. Cada uno de estos tipos de proteinas pueden retirarse de la solucion si la mezcla de proteinas se pasa a traves de una columna en la que la molecula especifica de interracion (sustrato, ligando, anticuerpo, etc.) se une mediante enlace covalentes con un material inerte e inmovilizado (la matriz). Si, por ejemplo, una preparacion imura de un receptor para acilcolina se pasa por una columna que contiene cuentas de agarosa a la que se une un anlogo de acetilcolina, el receptor se une de modo especifico con las cuentas siempre que las condiciones en la columna sean adecuadas para promover la interaccion. Una vez que todas las proteinas contaminantes pasaron por la columna y salieron por el fondo, las moleculas del receptor para actilcolina pueden desplazarse de sus sitios de union en la matriz mediante el cambio de la composicion ionica o el pH del solvente en la columna. Por lo que separan proteinas con base en su tamano o carga, la cromatografia por afinidad puede lograr una purificacion casi total de la molecula deseada en un solo paso.
친화성 크로마토 그래피
지금까지 설명한 기술은 단백질의 대체적인 특성을 사용하여 정제 또는 분별을 수행합니다. 친 화성 크로마토 그래피라고하는 또 다른 정제 기술은 단백질의 고유 한 구조적 특성을 활용하여 한 종의 단백질을 용액에서 구체적으로 제거하고 다른 종은 용액에 남아있게합니다. 단백질은 기질이있는 효소, 리간드가있는 수용체, 항체가있는 항원 등 특정 물질과 상호 작용합니다. 이러한 유형의 단백질 각각은 단백질 혼합물이 특정 상호 작용 분자 (기질, 리간드, 항체 등)가 물질에 공유 결합되어있는 컬럼을 통과 할 경우 용액에서 제거 될 수 있습니다. ). 예를 들어, 아실 콜린 수용체의 imura 제제가 아세틸 콜린 유사체가 결합하는 아가 로스 비드가 포함 된 컬럼을 통과하는 경우, 컬럼의 조건이 상호 작용을 촉진하기에 적절한 한 수용체는 비드와 특이 적으로 결합합니다. 모든 오염 단백질이 컬럼을 통과하여 바닥을 벗어나면, 컬럼에있는 용매의 이온 구성 또는 pH를 변경하여 액틸 콜린 수용체 분자를 매트릭스의 결합 부위에서 대체 할 수 있습니다. 크기 또는 전하를 기준으로 단백질을 분리함으로써 친화성 크로마토 그래피는 원하는 분자를 한 번에 거의 전체적으로 정제 할 수 있습니다.
친화성 크로마토 그래피-특정단백질과의 상호작용을 알 수 있음
DETERMINACION DE LAS INTERACCIONES PROTEINAS-PROTEINAS 단백질-단백질 상호 작용의 결정
una de las maneras de aprender respecto a la funcion de una proteina consiste en identificar las proteinas con las que interactua. Se cuanta con varias tecnicas disponibles para identificar que proteinas de una celula podrian interactuar con una proteina determinda que ya se identifico. Una de estas tecnicas acaba de describirse: la cromatografia por afinidad.
단백질의 기능에 대해 배우는 방법 중 하나는 상호 작용하는 단백질을 식별하는 것입니다. 세포에서 어떤 단백질이 이미 확인 된 특정 단백질과 상호 작용할 수 있는지 확인하는 데 사용할 수있는 몇 가지 기술이 있습니다. 이러한 기술 중 하나 인 친화성 크로마토 그래피가 방금 설명되었습니다.
Otra tecnica utiliza anticuerpos. Por ejemplo, considerese que la proteina A, que ya se identifico y purifico, es parte de un complejo con otras dos proteins en el citoplasma, las proteinas B y C. Una vez que la proteina A se purifica, puede obtenerse un anticuerpo contra esta proteina y usarse como sonda para unirse y retirar la proteina A de la solucion. Si se prepara un extrato celular que contenga el complejo protenico A-B-C y el extrato se incuba con el anticuerpo contra A, la union del anticuerpo con la proteina A suele producir la coprecipitacion de otras proteinas unidas con A, en este caso las proteinas B y C, que pueden identificarse en seguida. La coprecipitacion de los fragmentos de DNA por el empleo de la tecnica ChIP se ilustro en la figura 12.41.
또 다른 기술은 항체를 사용합니다. 예를 들어, 이미 확인 및 정제 된 단백질 A가 세포질에있는 두 개의 다른 단백질 인 단백질 B와 C와 복합체의 일부라고 생각해보십시오. 단백질 A가 정제되면 이에 대한 항체를 얻을 수 있습니다. 용액에서 단백질 A를 결합하고 제거하기위한 프로브로 사용됩니다. ABC 단백질 복합체를 포함하는 세포 추출물이 준비되고 추출물이 A에 대한 항체와 함께 배양되는 경우, 항체와 단백질 A의 결합은 일반적으로 A와 결합 된 다른 단백질,이 경우에는 단백질 B 및 C의 공침을 생성합니다. , 즉시 식별 할 수 있습니다. ChIP 기술을 사용한 DNA 단편의 공침은 그림 12.41에 설명되어 있습니다.
La tecnica de uso mas frecuente para buscar interacciones proteina- proteina es el sistema de DOS HIBRIDOS DE LEVADURA que Stanly Field y Ok- Kyu Song de la Nueva York State University en Stony Brook inventaron en 1989. Esta tecnica se ilustra en la figura 18.27 y depende de la expresion de un gen reportero, como la galactosidasa B (lac Z), cuya actividad es facil de vigilar mediante una prueba que detecta un cambio de color en presencia de la enzima en una poblacion de celulas de levaduras, La expresion del gen lacZ en este sistema se activa por una proteina particular (un factor de transcripcion). que contiene dos dominios, un dominio para union con DNA y un dominio de activacion.
단백질-단백질 상호 작용을 찾는 데 가장 자주 사용되는 기술은 1989 년에 뉴욕 주립대 스토니 브룩의 Stanly Field와 송옥규가 발명 한 TWO YEAST HYBRID 시스템입니다.이 기술은 그림 18.27에 설명되어 있으며 발현에 따라 달라집니다. 갈 락토시다 제 B (lac Z)와 같은 리포터 유전자의 활성은 효모 세포 집단에서 효소의 존재하에 색 변화를 감지하는 테스트로 모니터링하기 쉽습니다.이 시스템의 lacZ는 특정 단백질 (전사 인자). 두 개의 도메인, DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인을 포함합니다.
유전자는 ‘암을 위해’ 존재하는 것이 아니다 – Sciencetimes
1. 루드비히 폰 버틀란피, <일반체계이론>(대우학술총서번역 32), 민음사, 19902. Ludwig von Bertalanffy, An Outline of General System Theory, The British Journal for the Philosophy of Science, Vol. 1, No. 2. (Aug., 1950), pp. 134-1653
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이 기술의 핵심은 효모의 전사인자 단백질을 둘로 쪼개는 데서 시작된다. 전사인자 단백질은 기능에 따라 두 개의 도메인(damain)으로 나눌 수 있는데, DNA에 결합하는 부위와, 전사를 활성화시키는 부위가 그것이다. 하나였던 단백질을 둘로 쪼개 놓으면 두 단백질이 결합하기 전까지는 전사인자로서의 기능을 잃게 된다.
송옥규 박사의 아이디어는 간단하다. 둘로 쪼갠 전사인자 각각에 결합여부를 알고 싶은 단백질들을 융합(fusion)하는 것이다. 잡종단백질을 만드는 셈인데, 단백질은 기능에 따라 도메인으로 구획되어 있기 때문에 이런 조작이 가능하다. 두 단백질이 결합하게 되면, 둘로 쪼개 놓은 전사인자의 DNA 결합 부위와 전사활성 부위가 가까워지게 되고 전사인자로서의 기능을 되찾는다.
이제 할 일은 전사인자가 발현시키는 유전자를 확인하는 것 뿐이다. 이렇게 확인하는 유전자를 리포터(reporter)라고 부르는데, 다양한 종류의 리포터가 존재한다. 예를 들어 송옥규 박사는 베타-갈락토시데이즈(beta-galactosidase)를 사용했다. 베타-갈락토시데이즈는 어떤 화합물과 반응하면 효모를 파랗게 변색시킨다.
El dominio de union con DNA media la union con el promotor y el dominio de activacion con el promotor y el dominio de activacion media la interaccion con otra proteinas participantes en la activacion de la expresion del gen. Ambos dominios deben estar presente para que haya transcripcion. Para emplear esta tecnica se preparan dos tipos diferentes de moleculas de DNA recombinante. Una molecula de DNA contiene un segmento de DNA que codifica el dominio de union con DNA del factor de transcripcion unido con un segmento de DNA que codifica la proteina "carnada" (x). La proteinacarnada es la aque se caracterizo y aquella para la que se buscan compuestos potenciales de union. Cuando este DNA recombinante se expresa en una celula de levadura, la celula produce una preoteina hibrida como la que se muestra en la figura 18.27b. La otra molecula de DNA contiene una porcion del factor de transcripcion que codifica el dominio de activacion union con el DNA que codifica una proteina desconocida (Y).
DNA 결합 도메인은 프로모터와의 결합, 활성화 도메인은 프로모터와의 결합을 매개하고, 활성화 도메인은 유전자 발현 활성화에 관여하는 다른 단백질과의 상호 작용을 매개한다. 전사(transcripcion)가 발생하려면 두 도메인이 모두 있어야합니다. 이 기술을 사용하기 위해 두 가지 유형의 재조합 DNA 분자가 준비됩니다. DNA 분자는 "미끼"단백질 (x)을 인코딩하는 DNA 세그먼트에 연결된 전사 인자의 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 DNA 세그먼트를 포함합니다. 다육 단백질proteinacarnada은 특성화 된 단백질이며 잠재적 인 결합 화합물을 찾는다. 이 재조합 DNA가 효모 세포에서 발현되면 세포는 그림 18.27b에 표시된 것과 같은 잡종 단백질을 생성합니다. 다른 DNA 분자는 미지의 단백질 (Y)을 암호화하는 DNA 결합 활성화 도메인을 암호화하는 전사 인자의 일부를 포함합니다.
Estos DNA (o cDNA como se les conoce) se preparan de los m RNA por accion de la transcriptasa inversa como se describe en la pagina 774. Asumase que Y es una proteina capaz de unirse con la proteina carnada. Cuando un DNA recombinante que codifica Y se expresa en una celula de levadura, la celula produce una proteina hibrida como la mostrada en la figura 18.27c. Cuando se produce en una sola celula, ni la proteina hibrida que contiene X ni la que contiene Y son capaces de activar la transcripcion del gen lacZ . Sin embargo, si estas dos moleculas de DNA recombinante particulares se introducen en la misma celula de levadura, las proteinas X y Y pueden interactuar una con la otra para reconstituir un factor de transcripcion funcional, un fenomeno que puede detectarse por la capacidad de la celula para producir galactosidasa B. Con esta tecnica los investigadores pueden "pescar" proteinas codificadas por genes desconocidos capaces de interactuar con la proteina "carnada". La metodologia Y2H es en particular idonea para la deteccion sistematica de un gran numero de proteinas, y su empleo en estudios proteomicos a gran escala (alto rendimiento) se expone en la pagina 62.
이러한 DNA (또는 알려진대로 cDNA)는 774 페이지에 설명 된 바와 같이 역전사 효소의 작용에 의해 m RNA로부터 준비됩니다. Y가 미끼 단백질에 결합 할 수있는 단백질이라고 가정합니다. Y- 암호화 재조합 DNA가 효모 세포에서 발현 될 때, 세포는 그림 18.27c와 같이 하이브리드 단백질을 생성합니다. 단일 세포에서 생산되는 경우 X를 포함하는 하이브리드 단백질이나 Y를 포함하는 하이브리드 단백질은 lacZ 유전자의 전사를 활성화 할 수 없습니다. 그러나 이러한 두 가지 특정 재조합 DNA 분자가 동일한 효모 세포에 도입되면 단백질 X와 Y가 서로 상호 작용하여 기능적 전사 인자를 재구성 할 수 있습니다.이 현상은 갈락토시다 제 B를 생산하는 세포의 능력에 의해 감지 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 단백질 "미끼"와 상호 작용할 수있는 알려지지 않은 유전자에 의해 암호화 된 단백질을 "낚시"할 수 있습니다. Y2H 방법론은 특히 많은 수의 단백질을 체계적으로 검출하는 데 적합하며 대규모 (고 처리량) 단백질체 연구에서의 사용은 62 페이지에서 설명합니다.
figura 18.27 USO DEL SISTEMA DE DOS HIBRIDOS DE LEVADURAS. 그림 18.27 YEAST TWO HYBRID 시스템의 사용.
Esta prueba para la interaccion entre dos proteinas depende de que una celula sea capaz de reunir dos partes de un factor de transcripcion.(a)
Las dos partes del factor de transcripcion ( el dominio para union con DNA y el dominio de activacion), se ven aqui conforme el factor de transcripcion se une con el promotor de un gen (lacZ) que codifica la galactosidasa B. (b)
En este caso, una celula de levadura sintetizo el dominio para la union con DNA del factor de transcripcion unido con una proteina X "carnada". Este complejo no puede activar la transcripcion. (c)
En este caso, una celula de levadura sintetizo el dominio de activacion del factor de transcripcion unido con una proteina Y desconocida "pescada". Este complejo no puede activar la transcripcion. (d)
Una celula de levadura sintetizo las proteinas X y Y , lo que reconstituye un factor de transcripcion completo y permite la expresion de lacZ, que es facil de detectar. (e)
Si el segundo DNA codifico una proteina, por ejemplo, Z, que no pudo unirse con X, la expresion del gen reportero no se habria detectado.
두 단백질 간의 상호 작용에 대한 이 테스트는 전사 인자의 두 부분을 결합 할 수있는 세포에 따라 다릅니다. (A) 전사 인자의 두 부분 (DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인)은 전사 인자가 갈락토시다 제 B를 코딩하는 유전자 (lacZ)의 프로모터에 결합하기 때문에 여기에서 볼 수 있습니다. (b) 이 경우, 효모 세포는 "미끼"단백질 X에 결합 된 전사 인자의 DNA 결합 도메인을 합성했습니다. 이 복합체는 전사를 활성화 할 수 없습니다. (c) 이 경우, 효모 세포는 알려지지 않은 "낚시 아웃"단백질 Y와 결합 된 전사 인자 활성화 도메인을 합성했습니다. 이 복합체는 전사를 활성화 할 수 없습니다. (d) 효모 세포는 단백질 X와 Y를 합성하여 완전한 전사 인자를 재구성하고 검출하기 쉬운 lacZ의 발현을 허용합니다. (e) 두 번째 DNA가 X에 결합 할 수없는 단백질 (예 : Z)을 암호화했다면 리포터 유전자의 발현이 감지되지 않았을 것입니다.
En anos recientes se ha adaptado para utilizar en celulas de mamiferos el procedimiento de dos hibridos, cuyos estudios iniciales se hicieron en levaduras, Hasta la fecha, los estudios que utilizan el sistema de dos HIBRIDOS EN CELULAS DE MAMIFEROS tienden a orientarse las interaciones de proteinas especificas y no a la deteccion sistematica de bibliotecas de proteinas, a gran escala.
최근에는 두 가지 하이브리드 절차가 포유류 세포에 사용되도록 조정되었으며 초기 연구는 효모에서 수행되었으며 현재까지 포유류 세포에서 두 가지 하이브리드 시스템을 사용한 연구는 단백질 상호 작용에 초점을 맞추는 경향이 있습니다. 대규모 단백질 라이브러리의 체계적인 탐지가 아닙니다.
Electroforesis en gel de poliacrilamida 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)
ELECTROFORESIS es otra tecnica que se utiliza con frecuencia para fraccionar proteinas; depende de la capacidad de moleculas cargadas para migrar cuando se colocan en un campo electrico. La separacion electroforetica de proteinas casi siempre se realiza por ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE), en la que las proteinas son impulsadas por una corriente que se aplica a traves de una matriz gelatinosa. La matriz se compone de polimeros de una pequena molecula organica (acrilamida) que establece enlaces cruzados para formar un tamiz molecular. Puede formarse un gel de poliacrilamida como una losa delgada entre dos placas de vidrio o como un cilindro dentro de un tubo de vidrio. Una vez que el gel se polimeriza, la losa (o tubo) se suspende entre dos compartimientos que contienen un amortiguador en el que se sumergen electrodos opuestos. En un gel en forma de losa, la muestra concentrada que contiene las proteinas se coloca en ranuras sobre el borde superior del gel, como se muestra en el paso 1 de la figura 18.28.
ELECTROPHORESIS는 단백질을 분해하는 데 자주 사용되는 또 다른 기술입니다. 전기장에 놓일 때 전하 분자가 이동하는 능력에 달려 있습니다. 단백질의 전기 영동 분리는 거의 항상 POLYACRYLAMIDE GEL (PAGE)의 ELECTROPHORESIS에 의해 수행되며, 여기서 단백질은 젤라틴 매트릭스를 통해 적용되는 전류에 의해 구동됩니다. 매트릭스는 분 자체를 형성하기 위해 가교되는 작은 유기 분자 (아크릴 아미드)의 중합체로 구성됩니다. 폴리 아크릴 아미드 겔은 두 개의 유리판 사이에 얇은 슬래브로 또는 유리관 내의 실린더로 형성 될 수 있습니다. 겔이 중합되면 슬래브 (또는 튜브)가 반대 전극이 침진된 완충액이 들어있는 두 구획 사이에 매달려 있습니다. 슬래브 젤에서 단백질을 포함하는 농축 된 샘플은 그림 18.28의 1 단계에 표시된 것처럼 젤 상단 가장자리의 홈에 배치됩니다.
La muestra de proteina se prepara en una solucion que contiene sacarosa o glicerol, cuya densidad impide que la mezcla se combine con el amortiguador en el comparticmiento superior. Luego se aplica voltaje entre los compartimientos del amortiguador y la corriente fluye por la losa, lo que hace que las proteinas se muevan hacia el electrodo con carga opuesta. (paso 2). Por lo general la separacion se efectua con amortiguadores alcalinos, lo que ocasiona que las proteinas tengan una carga negativa y las obliga a migrar hacia el anodo de carga positiva en el extremo contrario del gel. Despues de la eletroforesis, la losa se retira de las placas de vidrio y se tien (paso 3)
El movimiento relativo de las proteinas por un gel de poliacrilamida depende de la densidad de carga (carga por unidad de masa) de las moleculas. Mientras mayor sea la densidad de carga, la proteina se impulsa con mas fuerza por el gel y por lo tanto, la migracion es mas rapida. No obstante, la densidad de carga es solo un factor importante en el fraccionamiento por PAGE; EL TAMANO Y LA FORMA Tambien influyen.
단백질 샘플은 슈크로스 또는 글리세롤을 포함하는 용액에서 준비되며, 그 밀도는 혼합물이 상부 구획의 완충액과 결합하는 것을 방지합니다. 그런 다음 버퍼 구획 사이에 전압이 적용되고 슬래브를 통해 전류가 흐르면서 단백질이 반대로 하전 된 전극으로 이동합니다. (2 단계). 일반적으로 분리는 알칼리성 완충액으로 이루어지며, 이로 인해
단백질: 음전하를 띠고 ,젤의 반대쪽 끝에서 양전하를 띤 양극으로 이동.
전기 영동 후 유리판에서 슬래브를 제거하고 놓는다 (3 단계). 폴리 아크릴 아미드 겔을 통한 단백질의 상대적인 이동은 분자의 전하 밀도 (단위 질량 당 전하)에 따라 다릅니다. 전하 밀도가 높을수록 단백질이 젤을 통해 더 강하게 추진되므로 이동 속도가 빨라집니다.
전하 밀도 높을수록>이동속도 빨라짐!!
그러나 전하 밀도는 PAGE 분별에서 중요한 요소 중 하나 일뿐입니다. 크기와 모양 또한 영향을 미칩니다.
La poliacrilamida forma un tamiz molecular con enlaces cruzados que enreda las proteinas que pasan por el gel, Entre mayor sea la proteinas, mas se enreda y migra con mas lentitud. La forma tambien es un factor importante, porque las proteinas globulares compactas se mueven mas rapido que las proteinas fibrosas alargadas de masa molecular similar. La concentracion de acrilamida ( y el agente de los enlaces cruzados) que se emplea para hacer el gel es otro factor importante. A menor concentracion de acrilamida, menos enlaces cruzados se forman en el gel y la migracion de una molecula protenicas determinada puede ser mas rapida. Un gel que contiene 5% de acrilamida podria ser util para separar proteinas de 60 a 250 kDa, en tanto que el gel con 15% de acrilamida permitiria separar proteinas de 10 a 50kDa.
폴리 아크릴아마이드는 겔을 통과하는 단백질을 얽히는 가교 분 자체를 형성하며, 단백질이 클수록 얽히게되고 더 느리게 이동합니다. 컴팩트 한 구형 단백질은 유사한 분자 질량의 길쭉한 섬유질 단백질보다 빠르게 움직이기 때문에 모양도 중요한 요소입니다. 젤을 만드는 데 사용되는 아크릴 아미드 (및 가교제)의 농도는 또 다른 중요한 요소입니다. 아크릴 아미드 농도가 낮을수록 겔에서 가교가 덜 형성되고 주어진 단백질 분자의 이동이 더 빨라질 수 있습니다. 5 % 아크릴 아미드를 포함하는 젤은 60 ~ 250kDa에서 단백질을 분리하는 데 유용 할 수있는 반면, 15 % 아크릴 아미드를 포함하는 젤은 10 ~ 50kDa에서 단백질을 분리 할 수 있습니다.
El progreso de la electroforesis se sigue al observar la migracion de un tinte rastreador cargado que se mueve justo por delante de las proteinas mas rapidas (paso 2). Despues que el tinte rastreador se movio a la localizacion deseada, la corriente se corta y el gel se retira de su recipiente.
전기 영동의 진행은 더 빠른 단백질 바로 앞쪽으로 이동하는 하전 된 추적 염료의 이동을 관찰합니다 (2 단계). 추적 염료가 원하는 위치로 이동 한 후 전류가 꺼지고 젤이 용기에서 제거됩니다.
figura 18.28 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA.
Las muestras de proteinas suelen disolverse en una solucion de sacarosa cuya densidad impide que la muestra se mezcle con el amortiguador y luego se carga en los pozos con una pipeta fina como se muestra en el paso 1. En el paso 2 se aplica una corriente directa al gel, lo que ocasiona que las proteinas se muevan en la poliacrilamida en carriles paralelos. Cuando se realiza en el detergente SDS, como casi siempre sucede, las proteinas se mueven como bandas a velocidades inversamente proporcionales a su masa molecular. Una vez que la electroforesis se completa, el gel se retira del marco de vidrio y se tine ne una charola (paso 3).
그림 18.28 POLYACRYLAMIDE GEL의 전기 추출.
단백질 샘플은 일반적으로 밀도로 인해 샘플이 버퍼와 혼합되는 것을 방지하는 자당 용액에 용해 된 다음 1 단계에 표시된대로 미세한 피펫으로 웰에로드됩니다. 2 단계에서 직류가 겔에 적용되어 폴리아크릴아미드에서 평행 한 차선으로 이동하는 단백질. 거의 항상 그렇듯이 SDS 세제에서 수행 할 때 단백질은 분자 질량에 반비례하는 속도로 밴드로 이동합니다. 전기 영동이 완료되면 젤을 유리 프레임에서 제거하고 트레이에 놓습니다 (3 단계).
Por lo general el gel se tine con azul Coomassie o tincion de plata para revelar la localizacion de las proteinas. Si las proteinas tienen marca radiactiva, su localizacion puede reconocerse al presionar el gel contra un fragmento de pelicula para rayos X a fin de producir una autorradiografia o el gel puede rebanarse enfracciones y las proteinas individuales aislarse. Una alternativa consiste en transferir las proteinas del gel por un segundo procedimiento electroforetico a una membrana de nitrocelulosa para formar una mancha. Las proteinas se absorben en la superficie de la membrana en las mismas posiciones relativas que ocupaban en el gel. En una inmunotransferencia (Western blot), las proteinas en la membrana se identifican por su interaccion con anticuerpos especificos.
겔은 일반적으로 단백질의 위치를 나타 내기 위해 쿠마시 블루 또는 실버 스테인으로 염색됩니다. 단백질이 방사성 표지 된 경우 X- 선 필름 조각에 젤을 눌러서 자동 방사선 사진을 생성하거나 젤을 분획으로 슬라이스하고 개별 단백질을 분리하여 단백질의 위치를 인식 할 수 있습니다. 대안은 두 번째 전기 영동 절차에 의해 겔 단백질을 니트로 셀룰로스 막으로 옮겨 스폿을 형성하는 것입니다. 단백질은 젤에서 차지하는 것과 동일한 상대적 위치에서 막 표면에 흡수됩니다. 면역 블롯 (Western blot)에서 막의 단백질은 특정 항체와의 상호 작용으로 식별됩니다.
SDS-PAGE- La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) suele llevarse a cabo en presencia del detergente con carga negativa sulfato de dodecilo sodico (SDS), que se une en grandes cantidades con todos los tipos de moleculas de proteinas. La repulsion electrostatica entre las moleculas unidas de SDS hace que las proteinas se desplieguen de manera similar a un baston, lo que elimina las diferencias en la forma como factor para la separacion. El numero de moleculas de SDS que se unen con una proteina es casi proporcional a la masa molecular de la misma. Por consiguiente, cada especie de proteinas, sin importar el tamano, tiene una densidad de carga equivalente y se impulsa por el gel con la misma fuerza, Sin embargo, como la poliacrilamida tiene muchos enlaces cruzados, las protinas mas grandes se retienen en mayor medida que las pequenas. Como resultado, las proteinas se separan por SDS-PAGE con base en una sola propiedad: su masa molecular. Ademas de separar las proteinas de una mezcla, la tecnica SDS-PAGE puede usarse para determinar la masa molecular de varias proteinas mediante la comparacion de las posiciones en las bandas con las producidas por proteinas de tamano conocido. En la pagina 146 y 173 se muestran ejemplos de SDS-PAGE.
SDS-PAGE- 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)은 일반적으로 모든 유형의 단백질 분자에 다량으로 결합하는 음전하 세제 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)의 존재하에 수행됩니다. 결합 된 SDS 분자 사이의 정전 기적 반발은 단백질이 막대 모양으로 펼쳐지도록하여 분리 요인으로서의 모양 차이를 제거합니다. 단백질에 결합하는 SDS 분자의 수는 단백질의 분자 질량에 거의 비례합니다. 결과적으로 단백질의 각 종은 크기에 관계없이 동일한 전하 밀도를 가지며 동일한 힘으로 겔을 통해 추진되지만 폴리 아크릴 아미드는 가교가 많기 때문에 작은 단백질보다 더 큰 단백질이 더 많이 유지됩니다. . 결과적으로 단백질은 분자 질량이라는 단일 속성을 기반으로 SDS-PAGE에 의해 분리됩니다. 혼합물에서 단백질을 분리하는 것 외에도 SDS-PAGE 기술을 사용하여 밴드의 위치를 알려진 크기의 단백질에 의해 생성 된 위치와 비교하여 다양한 단백질의 분자 질량을 결정할 수 있습니다. SDS-PAGE의 예는 146 및 173 페이지에 나와 있습니다.
FIGURA 18.29 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL EN GEL.
Gel de poliacrilamida bidimensional de proteinas cromosomicas no histonas de la celula HeLa marcadas con [35S] metionina. Con esta tecnica pueden resolverse mas de mil proteinas diferentes.
그림 18.29 GEL의 2 차원 전기식 법. [35S] 메티오닌 표지 HeLa 세포 비 히스톤 염색체 단백질의 2 차원 폴리 아크릴 아미드 겔. 이 기술을 사용하면 천 개 이상의 다른 단백질을 해결할 수 있습니다.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL EN GEL
En 1975 Patrick O'Farrell, de la California University, en San Franciso, desarrollo una tecnica llamada electroforesis bidimensional en gel para fraccionar mezclas complejas de proteinas con el uso de dos propiedades diferentes de las moleculas. Primero, las proteinas se separan en un gel tubular segun su punto isoelectrico mediante una tecnica llamada Enfoque ISOELECTRICO. Tras la separacion, el gel se retira y se coloca arriba de una losa de poliacrilamida saturada con SDS para someterla a SDS-PAGE. Las proteinas se mueven hacia el gel de la losa y se separan de acuerdo con su masa molecular. Una vez separadas, las proteinas individuales pueden retirarse del gel y digerirse en fragmentos peptidicos susceptibles de analizarse mediante espectrometria de masa. La resolucion de esta tecnica es suficiente paradistinguir la mayor parte de las proteinas de una celula. Por su gran poder de resolucion, la electroforesis bidimensional en gel es ideal para detectar cambios en las proteinas presentes en una celula en distintas condiciones, en diferentes etapas de desarrollo o del ciclo celular o en distintos organismos. Sin embargo, la tecnica no es adecuada para diferenciar entre proteinas que tienen una masa molecular elevada, que son muy hidrofobas o de las que hay muy pocas copias en la celulas.
젤의 쌍방향 전기 법 1975 년 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 Patrick O'Farrell은 두 가지 다른 분자 특성을 사용하여 복잡한 단백질 혼합물을 분별하는 2 차원 겔 전기 영동이라는 기술을 개발했습니다. 첫째, 단백질은 ISOELECTRIC Approach라는 기술에 의해 등전점에 따라 관형 겔에서 분리됩니다. 분리 후 겔을 제거하고 SDS-PAGE 용 SDS 포화 폴리 아크릴 아미드 슬래브 위에 놓습니다. 단백질은 슬래브 젤로 이동하여 분자 질량에 따라 분리됩니다. 일단 분리되면 개별 단백질을 겔에서 제거하고 질량 분석법으로 분석 할 수있는 펩타이드 조각으로 분해 할 수 있습니다. 이 기술의 분해능은 세포에서 대부분의 단백질을 구별하기에 충분합니다. 뛰어난 분해능으로 인해 2 차원 겔 전기 영동은 다양한 조건에서, 다양한 발달 단계 또는 세포주기에서 또는 다른 유기체에서 세포에 존재하는 단백질의 변화를 감지하는 데 이상적입니다. 그러나이 기술은 분자량이 높거나 매우 소수성이거나 세포에 복제가 거의없는 단백질을 구별하는 데 적합하지 않습니다.
MEDICION Y ANALISIS DE PROTEINAS
Uno de los metodos mas sencillos y usuales para identificar las cantidad dep proteinas o acido nucleico presente en una solucion determinada es medir la cantidad de luz de una longitud de onda especifica que absorbe esa solucion. El instrumento empleado para efectuar esta medicion es el espectrofotometro. La solucion se deposita en un recipiente especial de cuarzo con lados planos (se usa cuarzo porque, a diferencia del vidrio, no absorbe la luz ultra violeta) llamado CUBETA, que se coloca en el haz de luz del espectrofotometro. La cantidad de luz que pasa por la solucion sin ser absorbida (es decir, la luz transmitida) se mide en fotoceldas del otro lado de la cubeta.
Dos de los 20 aa incorporados en las proteinas, la tirosina y la fenilalanina, absorben la luz del espectro ultravioleta, con una absorbancia maxima cercana a 280 nm. Si las proteinas en estudios tienen un porcentaje tipico de estos aminoacidos, la absorbancia de la solucion en esta longitud de onda proporciona una medida de la concentracion de proteina. Una alternativa es emplear varias pruebas quimicas, como las tecnicas de Lowry o de Biuret, en las que la proteina en solucion participa en una reaccion que produce un compuesto coloreado cuya concentracion es proporcional a la concentracion de proteinas.
단백질의 측정 및 분석
주어진 용액에 존재하는 단백질 또는 핵산의 양을 확인하는 가장 간단하고 가장 일반적인 방법 중 하나는 해당 용액에 의해 흡수되는 특정 파장의 빛의 양을 측정하는 것입니다. 이 측정을 수행하는 데 사용되는 기기는 분광 광도계입니다. 용액은 분광 광도계의 광선에 배치되는 CUVETTE라고하는 평평한면이있는 특수 석영 용기 (유리와 달리 자외선을 흡수하지 않기 때문에 석영이 사용됨)에 증착됩니다. 흡수되지 않고 용액을 통과하는 빛의 양 (즉, 투과 된 빛)은 큐벳의 반대쪽에있는 광전지에서 측정됩니다. 단백질에 포함 된 20 개의 aa 중 2 개인 티로신과 페닐알라닌은 280nm에 가까운 최대 흡광도로 자외선 스펙트럼의 빛을 흡수합니다. 연구에서 단백질이 이러한 아미노산의 전형적인 비율을 가지고 있다면,이 파장에서 용액의 흡광도는 단백질 농도의 척도를 제공합니다. 대안은 Lowry 또는 Biuret 기술과 같은 다양한 화학적 테스트를 사용하는 것입니다. 용액의 단백질이 단백질 농도에 비례하는 농도를 갖는 착색 된 화합물을 생성하는 반응에 참여합니다.
ESPECTROMETRIA DE MASA (MS)
Como se explica en la pagina 71, el campo emergente de la proteomica depende mucho del analisis de las proteinas mediante espectrometria de masa. Los espectrometros de masa son instrumentos analiticos que se usan sobre todo para medir las masas de moleculas, determinar formulas quimicas y estructura molecular, y para identificar sustancias desconocidas. Los espectrometros de masa realizan estas tareas mediante la conversion de sustancias de una muestra en iones gaseosos con cargas positivas, que se aceleran a traves de un tubo curvo hacia una placa con carga negativa, Cuando los iones pasan por el tubo, se someten a un campo magnetico que los separa uno de otros de acuerdo con su masa molecular (o, de manera mas precisa, segun su proporcion entre masa y carga (m/z). Los iones golpean un detector electronico que se localiza al final del tubo. Los iones mas pequenos viajan mas rapido y golpean el detector con mas rapidez que los iones mas grandes. La informacion del detector se convierte en una serie de picos del indice m/z ascendente.
질량 분석
71 페이지에 설명 된 것처럼 새로운 단백질 체학 분야는 질량 분석법에 의한 단백질 분석에 크게 의존하고 있습니다. 질량 분석기는 주로 분자 질량을 측정하고, 화학 공식과 분자 구조를 결정하고, 알려지지 않은 물질을 식별하는 데 사용되는 분석 기기입니다. 질량 분석기는 샘플의 물질을 양전하를 띤 기체 이온으로 변환하여 곡선 튜브를 통해 음전하를 띠는 플레이트를 향해 가속하는 방식으로 이러한 작업을 수행합니다. 이온이 튜브를 통과하면 자기장에 노출되어 튜브와 분리됩니다. 다른 하나는 분자 질량에 따라 (또는 더 정확하게는 질량 전하 비율 (m / z)에 따라 다릅니다. 이온은 튜브 끝에 위치한 전자 검출기에 부딪 힙니다. 작은 이온은 더 빨리 이동하고 더 큰 것보다 검출기에 더 빨리 부딪칩니다. 이온 검출기의 정보는 상승하는 m / z 인덱스의 일련의 피크로 변환됩니다.
Aunque los espectrometros de mas han sido el instrumento favoritos de los quimicos durante muchos anos, hace apenas unos 10 anos que losbiologos descubrieron sus sorprendentes poderes analiticos. Ahora, con la espectrometria de masa (MS), los bioquimicos pueden identificar a las proteinas que componen algun tipo de celula, organelo o complejo proteinico en cuestion de horas. Para realizar este analisis las proteinas suelen digerirse con tripsina y los peptidos resultantes se ionizan con suavidad y se convierten en gases por uno de dos procedimientos. El desarrollo de estas tecnicas de ionizacion de peptidos fue clave para adaptar la MS al estudio de las proteinas. En un procedimiento, llamado Desorcion Ionizada asistida por matriz (MALDI, matrix-assisted laser desorption ionization), la muestra de proteina se aplica como parte de una matriz cirstalina que se irradia con un pulso de laser. La energia del laser excita la matriz y la energia absorbida convierte los peptidos en iones gaseosos. En un procedimiento alternativo, la ionizacion de electroaerosol (ESI, electrospray ionization), se aplica un potencial electrico a una solucion peptidica, lo que hace que los peptidos se ionicen y el liquido se rocie como un fino aerosol de particulas cargadas que entran al espectrometro. Como actua sobre las moleculas en solucion, la ESI es adecuada para ionizar peptidos preparados con proteinas fracionadas mediante una tecnica de cromatografia liquida que se usa con mayor frecencia.
추가 분광기는 수년 동안 화학자들이 선호하는 도구 였지만 생물 학자들이 놀라운 분석 능력을 발견 한 것은 불과 10 년 전이었습니다. 이제 질량 분석법 (MS)을 통해 생화학 자들은 몇 시간 만에 일부 유형의 세포, 세포 기관 또는 단백질 복합체를 구성하는 단백질을 식별 할 수 있습니다. 이 분석을 수행하기 위해 단백질은 일반적으로 트립신으로 분해되고 생성 된 펩타이드는 두 가지 절차 중 하나를 통해 부드럽게 이온화되고 가스로 변환됩니다. 이러한 펩티드 이온화 기술의 개발은 MS를 단백질 연구에 적용하는 데 핵심이었습니다. MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization)라고하는 한 절차에서 단백질 샘플은 레이저 펄스로 조사되는 cirstaline 매트릭스의 일부로 적용됩니다. 레이저의 에너지는 매트릭스를 여기시키고 흡수 된 에너지는 펩티드를 기체 이온으로 변환합니다. 대체 절차 인 ESI (electrospray ionization)에서는 전위가 펩타이드 용액에 적용되어 펩타이드가 이온화되고 액체가 분광계에 들어가는 하전 입자의 미세 에어로졸로 분무됩니다. 용액의 분자에 작용하기 때문에 ESI는 더 자주 사용되는 액체 크로마토 그래피 기술에 의해 분별 된 단백질로 준비된 펩타이드를 이온화하는 데 적합합니다.
ESPECTROMETRIA DE MASA (MS)
-MALDI
-ESI
:IONIZAR A LOS FRAGMENTOS PROTEINAS, CARGARLOS POSITIVAMENTE!
Una vez que las masas moleculares de los peptidos en la muestra se conocen, la proteina completa puede identificarse mediante la busqueda en una basa de datos como se describe en la pagina 72. Si la proteina no se identifica sin ambiguedades, uno o mas de los peptidos generados mediante digestion con tripsina pueden fragmentarse en un segundo paso para someterlos a otra ronda de espectrometria de masa. La tecnica bifasica en cuestion (llamada MS en tandem o MS/MS) genera la secuencia aa de los peptidos, que despues podra ensamblarse en el grupo de proteinas del cual provinieron. MS/MS es tan potente que es posible digerir mezclas complejas de cientos de proteinas desconocidas, someterlas a la espectrometria de masas y conocer la identifdad de cada una delas proteinas de la mezcla, MS/MS tambien se ha usado para identificar las modificaciones postraducionales especificas que aparecen en una proteina particular, en un conjunto especifico de situaciones fisiologicas.
샘플에 포함 된 펩티드의 분자 질량이 알려지면 72 페이지에 설명 된대로 데이터베이스를 검색하여 전체 단백질을 식별 할 수 있습니다. 단백질이 명확하게 식별되지 않으면 트립신 분해에 의해 생성 된 하나 이상의 펩티드가 조각화 될 수 있습니다. 또 다른 질량 분석을위한 두 번째 단계입니다. 문제의 2 상 기술 (탠덤 MS 또는 MS / MS라고 함)은 펩타이드의 aa 서열을 생성하며, 이는 나중에 이들이 유래 한 단백질 그룹으로 조립 될 수 있습니다. MS / MS는 매우 강력하여 수백 개의 알려지지 않은 단백질의 복잡한 혼합물을 분해하여 질량 분석법을 적용하고 혼합물의 각 단백질의 정체를 알 수 있습니다. MS / MS는 또한 특정 포스트를 식별하는 데 사용되었습니다 특정 생리적 상황에서 특정 단백질에 나타나는 pos-traduccion 변형.
18.30 PRINCIPIO DE OPERACION DE UN ESPECTROMETRO DE MASA 18.30 질량 분광기의 작동 원리
18.8 IDENTIFICACION DE LA ESTRUCTURA DE PROTEINAS Y COMPLEJOS MULTISUBUNITARIOS
18.8 단백질 구조 및 다중 하위 복합체의 식별
La cristalografia por rayos X (o difraccion de rayos X) utiliza cristales de proteinas que se bombardean con un fino haz de rayos X (Figura 18.31). La radiacion que se dispersa (difracta) por los electrones de los atmos de la proteina golpea un detector sensible a los electrones situado detras del cristal. El patron de difraccion que el cristal produce depende de la estructura interna de la proteina; la gran cantidad de moleculas en el cristal refuerza las reflexiones y ocasiona que se comparte como si fuera una molecula gigante. Las posiciones e intensidades de los reflejos, como los de la placa fotografica de la figura 2.33, pueden relacionarse en forma matematica con las densidades electronicas dentro de la proteina poque son los electrones de los atomos los que produjeron esas reflexiones. La resolucion obtenida por la difraccion de los rayos X depende de la cantidad de manchas que se analice.
X 선 결정학 (또는 X 선 회절)은 미세한 X 선 빔으로 충격을받은 단백질 결정을 사용합니다 (그림 18.31). 단백질의 대기에서 전자에 의해 산란 된 (회절 된) 방사선은 결정 뒤의 전자에 민감한 검출기를 공격합니다. 결정이 생성하는 회절 패턴은 단백질의 내부 구조에 따라 다릅니다. 결정에있는 많은 수의 분자는 반사를 강화하고 마치 거대한 분자 인 것처럼 공유되게합니다. 그림 2.33의 사진 판에있는 것과 같은 반사의 위치와 강도는 이러한 반사를 생성하는 원자의 전자이기 때문에 단백질 내의 전자 밀도와 수학적으로 관련 될 수 있습니다. X 선 회절로 얻은 해상도는 분석되는 스팟의 양에 따라 다릅니다.
figura 18.31 ANALISIS POR DIFRACCION DE RAYOS X.
Diagrama de la difraccion de rayos X por atomos de un plano de un cristal en una placa fotografica. La SERIE ORDENADA DE LOS RAYOS DENTRO DEL CRISTAL PRODUCE UNA SERIE REPENTITIVA DE ONDAS CIRCULARES SUPERPUESTAS QUE SE DISPERSAN E INTERSECTAN LA PELICULA. Como sucede con la difraccion de la luz visible, las ondas forman un patron de interferencia que refuerzan unas a otras en algunos puntos de la pelicula y se cancelan entre si en otros puntos.
그림 18.31 X-RAY DIFFRACTION ANALYSIS. 사진 판의 결정면 원자에 의한 X- 선 회절 다이어그램. 유리 내부의 질서 정연한 일련의 레이는 영화를 분산시키고 교차시키는 일련의 초강력 원형 파를 생성합니다. 가시광 선의 회절과 마찬가지로 파동은 필름의 일부 지점에서 서로를 강화하고 다른 지점에서 서로 상쇄하는 간섭 패턴을 형성합니다.
La mioglobina fue la primera proteina cuya estructura se identifico por la difraccion de rayos X. La proteina se analizo de modo sucesivo con 6,2 y 1.4 A, con periodo de anos entre cada identificacion completa. Si se considera que los enlaces covalentes miden entre 1 y 1.5 A de largo, y los enlaces no covalentes tienen entre 2.8 y 4 A de longitud, la informacion reunida por una proteina depende de la resolucion lograda.
Esto se ilustra con una comparacion de la densidad electronica de una pequena molecula organica en cuatro niveles de resolucion (fig. 18.32). En la mioglobina, una resolucion de 6A fue suficiente para mostrar la manera en que la cadena polipeptidica se pliega y la localizacion de la fraccion hem, PERO NO PARA MOSTRAR LA ESTRUCTURA DENTRO DE LA CADENA. Una resolucion de 2A permitio separar los grupos de atomos unos de otros, mientas que con 1.4 A se reconocieron las posiciones de los atomos individuales. A la fecha se han determinado las estructuras de varios cientos de proteinas con resolucion de apenas 0.66A.
미오글로빈은 X 선 회절에 의해 구조가 확인 된 최초의 단백질로, 단백질은 6.2A와 1.4A로 연속적으로 분석되었으며 각 완전 확인 사이에는 몇 년의 기간이 있습니다. 공유 결합의 길이가 1 ~ 1.5A이고 비공유 결합의 길이가 2.8 ~ 4A 인 경우 단백질이 수집하는 정보는 달성 된 분해능에 따라 달라집니다. 이것은 4 단계 분해능에서 작은 유기 분자의 전자 밀도를 비교하여 설명합니다 (그림 18.32). 미오글로빈에서 6A의 분해능은 폴리펩티드 사슬이 접히는 방식과 헴 분획의 위치를 보여주기에 충분했지만 사슬 내부의 구조를 보여주지는 않았습니다. 2A의 분해능은 원자 그룹을 서로 분리 할 수 있었고 1.4A의 경우 개별 원자의 위치가 인식되었습니다. 지금까지 단 0.66A의 분해능을 가진 수백 개의 단백질 구조가 결정되었습니다.
Con los anos , la tecnologia de difraccion de rayos X mejoro mucho. Max Perutz tardo 22anos en resolver la estructura de la hemoglobina, una tera que en la actualidad requeriria unas pocas semanas. En la mayor parte de los estudios actuales:
(1) Se generan haces de rayos X intensos y muy enfocados con sincrotrones (pag.100), que son aceleradores de particulas de altra energia que producen rayos X como productos rayos X como productos intermediario y
(2) las placas fotograficas se sustituyeron por detectores electronicos muy sensibles (instrumentos unidos por carga o CCD) que proporcionan una lectura digitla de los datos de la difraccion. El uso de estos instrumentos junto con computadoras cada vez mas potentes permite a los investigadores reunir y analizar datos suficientes para reconocer la estructura terciaria de casi todas las proteinas en cuestion de horas. Como resultado de estos avances la cristalografia con rayo X se aplica al analisis de estructuras moleculares cada vez mas grandes. Es probable que la mejor forma de ilustrar estos sea con el exito obtenido en la identificacion de la estructura del ribosoma, que se explica en el capitulo 11. En la mayor parte de los casos, como sucedio con el estudio del ribosoma, el principal desafio en este campo es obtener cristales utiles.
수년에 걸쳐 X 선 회절 기술은 많이 향상되었습니다. Max Perutz는 현재 몇 주가 소요되는 치료법 인 헤모글로빈의 구조를 파악하는 데 22 년이 걸렸습니다. 대부분의 최근 연구에서 : (1) 강렬하고 집중된 X 선 빔은 싱크로트론 (100 페이지)으로 생성됩니다. 싱크로트론 (100 페이지)은 X 선을 중간체 및 (2) 사진 판은 회절 데이터의 디지털 판독을 제공하는 고감도 전자 검출기 (전하 연결 기기 또는 CCD)로 대체되었습니다. 점점 더 강력한 컴퓨터와 함께 이러한 기기를 사용하면 연구원은 몇 시간 만에 거의 모든 단백질의 3 차 구조를 인식 할 수있는 충분한 데이터를 수집하고 분석 할 수 있습니다. 이러한 발전의 결과로 X 선 결정학은 점점 더 큰 분자 구조의 분석에 적용됩니다. 이는 아마도 11 장에 설명 된 리보솜의 구조를 확인하는 데 성공한 것으로 가장 잘 설명됩니다. 대부분의 경우 리보솜 연구의 경우와 마찬가지로이 분야의 주요 과제는 유용한 결정을 얻는 것입니다.
Aunque la cristalografia por rayos X es ideal para identificar la estrutura de proteinas solubles que se prestan a la cristalizacion, puede ser muy desafiante en el estudio de estructuras complejas con multiples subunidades, como los ribosomas o los proteasomas, o para proteinas de membrana, de las que es dificil obtener los cristales tridimensionales necesarios para el analisis. A menudo el analisis estructural de estos tipos de muestras se realiza con una tecnica alternativa que aprovecha la ventaja del inmenso poder de resolucion del microscopio electronico y las tecnicas de procesamiento de imagen basadas en la computadora.
X 선 결정학은 결정화에 적합한 가용성 단백질의 구조를 확인하는 데 이상적이지만 리보솜 또는 프로 테아 좀과 같은 여러 하위 단위가있는 복잡한 구조 또는 어려운 구조의 막 단백질을 연구하는 데는 매우 어려울 수 있습니다. 분석에 필요한 3 차원 결정을 얻기 위해. 이러한 유형의 샘플에 대한 구조 분석은 종종 전자 현미경 및 컴퓨터 기반 이미지 처리 기술의 엄청난 분해능을 활용하는 대체 기술로 수행됩니다.
Existen dos metodos generales para el estudio de particulas individuales al microscopio electronico. En una estrategia, las particulas se colocan en una rejilla de miscroscopio electronico, se aplica tincion negativa y se secan al aire (como se explica en la pag 744). En la otra tecnica, que se conoce como Crismicroscopia electronica o crio- EM, las particulas se colocan con nitrogeno liquido sin fijacion ni tincion. Para los estudios de mayor resolucion, el uso de muestras con tincion negativa casi se sustituyo ya por particulas hidratadas congeladas, que tienen una probabilidad mucho menor de generar artefactos y son mas adecuadas para estudiar rasgos internos de la estructura de la particula. En ambos casos, las rejillas se colocan en la columna del microscopio y se toman fotografias de las particulas. Cada fotografia es una imagen bidimensional de una particula individual en la orientacion que asume cuando descansa en la rejilla. Cuando se promedian las imagenes bidimensionales de decenas de miles de muestras distintas en todas las orientaciones concebibles mediante un analisis computarizados de alto poder puede generarse una reconstruccion tridimensional de la particula con una resolucion cercana a 10 A. Con esta resolucion, los investigadores pueden seguir a la cadena polipeptidica de una proteina e incluso identificar la localizacion de las cadenas laterales voluminosas de aa. En la Figura 2.58 se ilustra un modelo de ribosoma eucariotico con base en la tecnica de crio-EM; en la figura 8-40c se incluye un modelo de vesicula cubierta con clatrina y en la figura 11.33 sesenala un modelo de una particula U1 snRNP.
La tecnica anterior, conocida como recostruccion uniparticulada, tambien es util para captar imagenes de un proceso dinamico, como la etapa de alargamiento de la sintesis proteinicas.
Con esta tecnica se han revelado varios de los cambios principales en la conformacion que ocurren despues de cada paso de la traduccion.
전자 현미경으로 개별 입자를 연구하는 일반적인 방법에는 두 가지가 있습니다. 한 가지 전략에서 입자는 전자 현미경 격자에 배치되고 네거티브 염색이 적용되고 공기 건조됩니다 (744 페이지에 설명 됨). 전자 chrismicroscopy 또는 cryo-EM으로 알려진 다른 기술에서 입자는 고정 또는 얼룩없이 액체 질소로 배치됩니다. 더 높은 해상도 연구의 경우, 네거티브 스테인드 샘플의 사용은 거의 아티팩트를 생성 할 가능성이 훨씬 낮고 입자 구조의 내부 특징을 연구하는 데 더 적합한 동결 된 수화 입자로 대체되었습니다. 두 경우 모두 격자를 현미경 기둥에 놓고 입자 사진을 찍습니다. 각 사진은 그리드에 놓일 때 가정하는 방향으로 개별 입자의 2 차원 이미지입니다. 상상할 수있는 모든 방향에서 수만 개의 서로 다른 샘플의 2 차원 이미지를 고출력 컴퓨터 분석으로 평균하면 입자의 3 차원 재구성이 10A에 가까운 해상도로 생성 될 수 있습니다.이 해상도를 사용하면 연구원은 단백질의 폴리펩티드 사슬을 계속하고 심지어 aa의 부피가 큰 측쇄의 위치를 확인합니다. 그림 2.58은 cryo-MS 기술에 기반한 진핵 리보솜 모델을 보여줍니다. 클라 트린으로 코팅 된 소포의 모델이 그림 8-40c에 표시되고 U1 snRNP 입자의 모델이 그림 11.33에 표시됩니다. uniparticulate reconstruction으로 알려진 이전 기술은 단백질 합성의 연장 단계와 같은 동적 프로세스의 이미지를 캡처하는데도 유용합니다. 이 기술은 번역의 각 단계 후에 발생하는 몇 가지 주요 구조 변화를 보여줍니다.
figura 18.32 DISTRUBUCION DE DENSIDAD ELECTRONICA DE UNA PEQUENA MOLECULA ORGANICA (DICETOPIPERACINA) CALCULADA CON VARIOS NIVELES DE RESOLUCION.
Con la resolucion mas baja (a) solo puede distinguirse la naturaleza anular, mientras que la resolucion mas alta (d) revela la densidad electronica alrededor de cada atomo (indicada por las lineas de contorno circular).
그림 18.32 다양한 분해능 수준으로 계산 된 작은 유기 분자 (DICETOPIPERACINE)의 전자 밀도 분산.
가장 낮은 해상도 (a)에서는 환형 특성 만 구별 할 수 있으며 가장 높은 해상도 (d)는 각 원자 주변의 전자 밀도를 나타냅니다 (원형 등고선으로 표시됨).
Ademas, las estructuras de resolucion atomica determinadas por cristalografia de rayos X pueden ajustarse en la reconstrucciones de microscopia electronica de menor resolucion para mostrar la forma en que interactuan las moleculas individuales que constituyen un complejo multisubunitario y como podrian trabajar juntas para realizar una actividad especifica. En la figura 18.33 se muestra la estructura terciaria de un filamento compuesto de a ctina y ADF ( un miembro de la familia de la cofilina) Las estructura de las dos proteinas se determinaron mediante estudios separados de cristalografia de rayos X y luego se ajustaron en un modelo de microscopia electronica de un filamento de actina-ADF. La mecanismo propuesto, mediante el cual las proteinas de la familia de la cofilina pueden inducir el corte y la despolimerizacion de un filamento de actina.
El analisis al microscopio electronico de muestra congeladas tambien es util en el estudio de proteinas de membrana, como el receptor nicotinico para acetilcolina (via experiemntal del cap.4). Este tipo de analisis requiere que las proteinas de membrana esten muy compactadas a temperaturas muy bajas (p. ej. -195C) en disposiciones cristalinas bidimensionales dentro del plano de la membrana. Dicha tecnica ofrece una ventaja sobre los estudios cristalograficos de rayos X de las proteinas de membrana, ya que la proteina permanece durante todo el proceso dentro de su membrana natural, en lugar de extraerse en detergente y cristalizarse en un ambiente no membranoso. Las estructuras ilustradas en la pagina 174 se obtuvieron de la combinacion de imagenes de alta resolucion de microscopia electronica, hechas de diferentes moleculas proteinicas, en angulos diversos en relacion con el haz de electrones. Esta tecnica se conoce como cristalografia electronica.
또한, X 선 결정학에 의해 결정된 원자 분해능 구조는 다중 서브 유닛 복합체를 구성하는 개별 분자가 어떻게 상호 작용하고 특정 활동을 수행하기 위해 함께 작동 할 수 있는지를 보여주기 위해 저해상도 전자 현미경 재구성에서 조정할 수 있습니다. 액틴과 ADF (코 필린 계열의 일원)로 구성된 필라멘트의 3 차 구조는 그림 18.33에 나와 있습니다. 두 단백질의 구조는 별도의 X- 선 결정학 연구에 의해 결정된 다음 전자 현미경 모델에 적합합니다. 액틴 -ADF 필라멘트. 코 필린 계열 단백질이 액틴 필라멘트의 절단 및 해중합을 유도 할 수있는 제안 된 메커니즘. 냉동 샘플의 전자 현미경 분석은 아세틸 콜린에 대한 니코틴 수용체와 같은 막 단백질 연구에도 유용합니다 (4 장의 실험을 통해). 이러한 유형의 분석은 막의 평면 내에서 2 차원 결정 배열에서 막 단백질이 매우 낮은 온도 (예 : -195C)에서 고도로 압축되어야합니다. 이 기술은 막 단백질의 X- 선 결정학 연구에 비해 이점을 제공합니다. 단백질은 세제로 추출되어 비막 환경에서 결정화되는 대신 천연 막 내에서 공정 전체에 남아 있기 때문입니다. 174 페이지에 설명 된 구조는 전자빔에 대해 다른 각도에서 다른 단백질 분자로 만든 고해상도 전자 현미경 이미지를 결합하여 얻은 것입니다. 이 기술은 전자 결정학으로 알려져 있습니다.
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