[Biologia] cap 18. 1-3

microscopicos!!

 

MO DE CAMPO CLARO

es un microscopio que utiliza un haz de luz+ un sistema de lentes opticos, para generar imagenes grandes de objetos muy pequenos

광학 렌즈 시스템 인 광선(haz de luz)을 사용하여 매우 작은 물체의 큰 이미지를 생성하는 현미경.

한계해상도 d가 줄어줄 수록(확대가 잘 되므로)=PODER DE RESDUCION(해상도)가 올라간다!!

d(상의 거리 비교!)

• d ojo humano=0.1mm
• d MO=0.2um(마이크로미터)
• d ME=0.3 nm!

3 caracteristicas!

• Poder de magnificacion 배율 (MO 에 따라)

poder del objetivo x poder ocular

대물렌즈x 접안렌즈

• Poder de Resolucion 해상도 (MO 에 따라)

선명한(nitido) 이미지를 제공하는 능력, limite de resolucion(d) 과 반비례한다

• Visibilidad (시료에 따라!!muestra)

mo de campo claro 에 대한 샘플은 거의 보이지 않기때문에 준비 단계가 필요하다

a) obtencion: 시료를 1cm^3로 얻는다

b) fijacion:단백질의 분해를 막고 세포를 죽이는 단계!

에탄올

아세틴 산

폼 알데하이드 이용

c) deshidratacion:시료의 물기 없애기

에탄올 70%,95% 100%를 사용한다

d) impregnacion 침...?: 시료를 단단하게하는 단계, 이 단계 이후에 자르는 단계가 이루어 질 수 있도록

parafino 와 cena를 이용한다!

e) corte: 샘플을 5mm 두께의 조각으로 자르기.

microtomo 와 cuchillo de acero를 이용!

f) aclaramiento: 벤젠|(benceno) / 톨루엔(tolueno)으로 함침 물질 제거

g) montura y tincion: 시료를 유리시트에 두고 염색한다

-hematoxilina, Eosina 물질을 이용한 기술 을 tecnica H&E로 부른다

-Tecnica de Feulgen : cromosoma 보라색을 이용하여 염색! (HCl+reactivo de schiff를 이용)

 

NA 개구수를 높이는것=N senα을 높이는 것!

n=indice de refraccion del medio=aceite de inmercion=n:1,5

 

MO con interferencia de ondas luminosas 광파 간섭이있는 광학 현미경

Son MO especiales, semejantes al MO de cc. Aprovechan el fenomeno de interferencia, ondas luminosas, para resaltar la escala de grises y no utilizan preparacion ni colorante

• cc MO와 유사한 특수 MO. 간섭 현상, 광파를 이용하여 그레이 스케일을 강조하고 준비물이나 염료를 사용하지 않습니다.

La interferencia ocurre entre el haz que atraviesa la muestra y el haz que no

• 샘플을 통과하는 빔(haz)과 그렇지 않은 빔 사이에 간섭(interferencia)이 발생
• 살아있는 세포를 관찰하기 위해 디자인 된 현미경 (mitosis/meiosis, motilidad con desplazamiento, movimiento intracelular, apoptosis)
• su d=mo de cc
• clases

-mo de contraste de fase (1ra generacion)

genera interferencia mieante una lente con forma de anillo, tiene 2 clases de haz de luz(haz central, haz periferico)

반지모양의 렌즈를 이용해 간섭을 가진다. 2 종류의 광선을 가짐

중심 광선과 옆 광선!

-mo de interferencia difernecial(dic, mo de nomarski 2da generacion con efecto 3D!,con prisma como lente ocular)

프리즘으로 접안렌즈를 대체하며 3D 효과를 얻는다

-mo de contraste con video y procesamiento de imagen (3ra generacion, dic, camara ccd, computadora, d=26nm)

HD 컴퓨터와 연결하여 비디오를 가짐. SPT 같은 기술이용에 사용된다

 

MICROSCOPIA DE FLORESCENCIA

특정 물체가 더 높은 강도의 빛을 흡수하고 (X 짧은) 낮은 강도의 빛을 방출하는 능력 (X 긴)

 

형광물질 ,Florosforos, florocromo를 이용한다

2 종류의 florosforos :인공적, 자연적

인공적인 형광물질은 anticuerpo에 모인다. de manera selectiva

농도있는 용액의 물질이나 세포안, 세포바깥의 에서 이용 될 수 있음

rodamiento, floresenina!

 

-anticuerpos 항체들은 주로 움직이는 단백질에게 영향을 미친다.

 

 

arqueorea victoria GFP (PROTEINA VERDE FLORESCENTE)

-3 개의 AA 를 구조적으로 가진다. (형광역활을하는), 다른 단백질이 아닌 그룹도 FLORESCENCIA를 가짐

 

MICROSCOPIA DE FLORESCENCIAS 기술들

대부분의 microscopia florescencia 형광 현미경은 광학현미경과 비슷한 정도의 한계 해상도(limite resductivo)를 가진다

형광현미경은 고 광자 에너지( foton de alta energia)를 이용해 시료를 자극해야 한다

->형광을 소비, 시료를 상하게 함

 

-FRET

Transferencia de energia por resonancia de fluorescencia

단백질의 cambio conformacional 이나 단백질끼리의 상호작용을 에너지 공명을 이용해 연구하는 기술

-MICROSCOPIA POR VIDEO Y PROCESAMIENTO DE IMAGEN

높은 해상도를 이용한 카메라를 이용해 25나노미터의 해상도를 가지는 이미지를 얻는 기술

예: pcg

-MICROSCOPIA MULTIFOTONICA

이 현미경에서는 여러 저 광자 에너지를 이용해 시료를 자극하여 형광 효과를 유발 (desencadenando el efecto de florescencia)

->시료를 보존할 뿐 아니라, 200um 마이크로미터의 깊이로 시료를 ~한다.

-MICROSCOPIA DE SUPERRESOLUSION

florosforos fotoactivables o fotoconmutables 라는 이름을 가지는 형광물질은 특정 빛에게만 형광을 유발한다.

STROM 기술->PA-GPF를 이용함! (자외선) 에서만 형광효과를 가짐)

20나노미터 이하의 limite resolutivo를 가진다!

-microscopio confocal de barrido laser

:단일 초점면 이미지 생성

->높은 해상도, 광학현미경처럼 cortes 를 이용!

 

 

microscopio electronico de transmicion

투과 전자 현미경!

-광선과 lentes electromagnetico전자기 렌즈(bobibas) 를 이용하는 현미경

-tejido조직, eucariota, procariota 세포를 관찰

-bobina objetivo , bobina proyectora 가 lente objetivo 와 ocular를 대신한다.

-d real = 10A, d practivo 3 A-> 작은 개구수의 덕분!

-한계해상도: 파장의 길이를 바꾸면 바꾼다! (예, 색을 바꾸기)

-voltaje 전압: 10.000~100.000! (일반적으로는 60.000v)

-준비과정 필요!

 

a obtencion

b fijacion (glutaraldehido 단백질 끼리의 결합부분, OsOH 지질을 고정)

C deshidratacion con etanol...

d aclaramiento:에탄올을 oxido de propileno로 지운다!

e impregnacion: 시료를 단단하게 함

polimerizacion de resinas epoxicas, polimerizacion de resinas acrilicas 를 이용!

f corte! 울트라 마이크로톰, 유리 칼이나 다이아몬드 칼을 이용하며 시료를 100nm로 자른다

g tincion y montura: grilla metalica에 시료를 올리고 염색! ->무거운 메탈 (acetato de uranio, citratro de plomo) 을 이용

->전자가 통과하는 것을 막는다

 

tem 투과전자현미경 을 위한 특별한 과정!

-coloracion negativa:다 분자 복합체 또는 바이러스와 같은 입자를 위해!

샘플은 대비에 의존하지 않음 ->주변을 색칠하기 때문에!

-그림자 모델: 입자를 위한 과정

음영과정은 진공상태에서 platino를 통해 이루어진다

-criofractura: mp, centrioles와 같은 여러 복잡한 단계 가있는 구조물 위해 쓰이는 기술

• 빨리얼린다 N liquido로 -170도에서!
• 자르기 fractura : 진공상태에서 차가운 칼을 이용해 자름
• 광학 조각 (optutivo): -40의 저온 챔버에서 진공 승화
• 플러시 증발: pt를 각을 이용해 더함 (그림자 모델처럼)
  
• 수직 증발:탄소를 수직으로 시료에 올린다: 탄소 와 플라티늄으로 몰드를 만듦!
• 복제: 탄소와 플라티늄으로 만든 틀을 제거, TEM을 이용해 관찰 (Muestra se desecha, imagen tiene efecto 3D)

crio-et기술도 이용! (sin corte, ni fractura!)

-metales pesado 를 더한 다음 세포의 약한부위를 골라 여러 micrografia를 다양한 각도에서 촬영

-3d효과를 이용한 컴퓨터 기술로 이미지 재구성!

 

criofijacion

고정제는 단백질을 변성시키고 침전시킬 수 있으며 "아티팩트"라는 결함적인 이미지를 생성하므로

고정제 대신 criofijacion: 액체질소, 액체 핼륨, 액체 프로핀을 이용한 빠른 동결을 이용하여 대체 가능

 

 

microscopio electronico de barrido (SEM) 주사전자 현미경

-3D효과를 시료의 표면으로부터 얻기위한 현미경 (내부x, 표면!!)

-단단한 시료를 관찰할수 있음 (깊이있는 campo!) ex: 벌레 등

-한계 해상도 20나노미터!

 

단계:

obtencion->fijacion->desecacion al vacio en frio con hielo seco CO2 -> tincion con Au입자 -> montura y observacion

 

AFM microscopio de fuerza atomica

-세포나 세포 소기관을 관찰하기 위한 것이 아닌 macromolecula나 복잡한 역학과정을 관찰하기 위해 디자인 된 현미경이다!

-laser을 이용

->스캔하는 동안 샘플 표면을 손바닥으로 비추는 프로브 조명 -렌즈 없음!!